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摘要：研究不同浓度白花三叶草（Trifolium repense L.）水浸液对草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草3种禾本科草坪草种子萌发、幼苗生长以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等保护酶活性和丙二醛含量的影响。结果表明，白花三叶草水浸液对3种草坪草种子发芽率、发芽势、幼苗苗高均表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用趋势；对幼苗根长均有不同程度的抑制作用，水浸液浓度越高，抑制作用基本上也越强；对种子发芽指数、幼苗鲜质量的影响则因草坪草种类的不同而不同。在不同浓度的白花三叶草水浸液处理下，3种草坪草幼苗SOD、CAT活性呈现“低浓度上升、高浓度下降”的趋势，POD、APX活性和丙二醛含量则不同程度地升高。
关键词：白花三叶草；草坪草；化感作用；种子萌发；幼苗生长
中图分类号： Q945.79 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0171-04
白花三叶草（Trifolium repense L.）为豆科车轴草属多年生草本植物，喜阳耐阴，具有适应性广、抗热抗寒性强、生长迅速、绿期长等优点，在世界各地作为优良草坪草广泛栽植。近年来，我国北方寒冷地区为了改善城市中草坪的适应性并延长其绿期，人们常将白花三叶草与冷季型禾本科草坪草混合建植草坪[1-2]。研究表明，白花三叶草会侵占禾本科草坪，在禾本科草坪上形成小群落，影响原有的景观效果[1]。白花三叶草入侵禾本科草坪过程中，化感作用（allelopathy）被认为是一个重要因素[3-6]。植物的化感作用是植物通过茎叶挥发、雨水淋溶、根系分泌、残体分解等途径向环境中释放化感物质（allelochemicals），从而对其他植物或自身的生长发育产生促进或抑制作用[6-7]。化感作用广泛存在于自然界中，是生态系统中自然的化學调控现象以及植物适应环境的一种机制。开展化感作用研究对于生态系统中植被形成及演替、植物生长发育调控具有重要意义[8]。研究表明，植物通过化感作用造成细胞伤害进而影响自身或其他植物生长发育过程中，植物细胞内活性氧自由基代谢失衡进而引起自由基积累以及膜脂过氧化，导致膜系统结构、功能受到损伤是重要原因之一[9-11]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等酶类是植物细胞在长期进化过程中形成的防御活性氧自由基毒害的保护酶系统，以维持植物体内活性氧自由基代谢的动态平衡[11-12]。目前，关于白花三叶草对冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株水浸液、挥发物、根系分泌物、腐解液等对受体植物种子萌发、幼苗生长的影响。研究表明，雨水淋溶是植物活体、残体释放化感物质的主要途径之一[13]。本研究以我国北方寒冷地区草坪建植中经常使用的3种冷季型禾本科草坪草即草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草为材料，用蒸馏水浸提白花三叶草植株模拟自然雨水淋溶过程，研究不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子萌发、幼苗生长、SOD等保护酶活性以及丙二醛（MDA）含量的影响，旨在为进一步研究白花三叶草侵占禾本科草坪的原因提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜的生长良好的白花三叶草全株采自东北农业大学校园内。受体植物草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.）种子均购自江苏圣园种子培育基地。
1.2 方法
1.2.1 白花三叶草水浸液的制备
将白花三叶草全株去除杂质，用蒸馏水洗净后用吸水纸吸干水分。取白花三叶草全株25 g，用剪刀剪成长1～2 cm的小段，倒入三角瓶中，加入 250 mL 蒸馏水浸泡48 h（每隔12 h用玻璃棒搅动1次），用布氏漏斗过滤，得到0.100 g/mL白花三叶草水浸液。用蒸馏水稀释该水浸液，分别获得0.005、0.025 g/mL水浸液，4 ℃保存备用。
1.2.2 草坪草种子萌发试验
采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验。首先用0.1%HgCl2溶液对3种草坪草种子消毒10 min，用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3次。分别选择大小均一、籽粒饱满的3种草坪草受体种子各100粒，用消毒过的镊子将其均匀放置于铺有2层滤纸的培养皿中，分别加入不同浓度（0.005、0.025、0.100 g/mL）的白花三叶草水浸液10 mL，以蒸馏水为对照（CK），每处理重复3次。试验期内适量补充蒸馏水以保持培养皿内滤纸湿润。将加有受体种子的培养皿放入人工气候箱中，于25 ℃进行培养，每隔 24 h 观察并记录萌发种子数（胚根或胚轴突破种皮1～2 mm为萌发）。3 d后计算发芽势（GE），7 d后计算发芽率（GR）、发芽势、发芽指数（GI）[6]。7 d后从每个培养皿随机挑选10株草坪草幼苗，用吸水纸吸干水分，用电子天平称量鲜质量，用直尺测量苗高、根长。各指标计算公式如下：
式中：IR为抑制率，%；C为对照值，T为处理值；当IR>0时，表示抑制作用；当IR<0时，表示促进作用。IR绝对值大小代表化感作用强弱[6]。
1.2.3 保护酶活性、丙二醛含量的测定
7 d后从每个培养皿随机挑选若干株草坪草幼苗，用蒸馏水洗净，用滤纸吸干水分，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱内保存待用。采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）法[14]测定SOD活性，以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位。采用过氧化氢还原法[14]测定CAT活性，以1 min 240 nm处吸光度减少0.01定义为1个活性单位。采用愈创木酚法[14]测定POD活性，将1min 470 nm处吸光度增加0.01定义为1个活力单位。参照陈建勋等的方法[15]测定APX活性，以1 min 290 nm处吸光度降低0.01定义为1个酶活性单位。采用硫代巴比妥酸法[14]测定丙二醛含量，每个指标均重复测定3次。 参考文献：
[1]李剑峰，张淑卿，师尚礼，等. 白三叶对禾草草坪的侵占性研究[J]. 现代农业科技，2008（22）：93-94，97.
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[4]税军峰，张玉琳，马永清.白三叶对黑麦草、弯叶画眉草的化感作用初探[J]. 草业科学，2007，24（1）：48-51.
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[6]余 婷，孟焕文，温艳斌，等. 白三叶根系分泌物对5种草坪草的化感作用[J]. 草地学报，2013，21（4）：729-736.
[7]彭晓邦，程 飞，张硕新. 核桃叶水浸液对不同产地黄芩的化感效应[J]. 草地学报，2011，19（5）：839-845.
[8]李 美，高兴祥，高宗军，等. 艾蒿对不同植物幼苗的化感作用初探[J]. 草业学报，2010，19（6）：114-119.
[9]李 键，刘 奕，洪 滔，等. 2种化感成分对木麻黄幼苗小枝活性氧含量和保护酶活性的影响[J]. 植物资源与环境学报，2013，22（2）：30-38.
[10]刘 迎，王金信，胡 燕，等. 白三叶草对苘麻和稗草的化感作用[J]. 植物保护学报，2006，33（4）：433-436.
[11]张 红，王进闯. 麻疯树（Jatropha curcas）叶浸提液对万寿菊（Tagetes erecta L.）幼苗生长和抗氧化酶活性的化感影响[J]. 安徽农业科学，2011，39（33）：20404-20406，20648.
[12]刘 威，袁晓婷，张艳艳，等. 胭脂红景天引种至西藏日喀则其渗透调节物质及保护酶活性的变化[J]. 植物研究，2013，33（6）：697-700.
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[14]高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006.
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[20]劉大林，王秀萍，胡楷崎，等. 高温胁迫对两种冷季型草坪草生理生化特性的影响[J]. 生态学杂志，2012，31（4）：811-815.
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关键词：白花三叶草；草坪草；化感作用；种子萌发；幼苗生长
中图分类号： Q945.79 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0171-04
白花三叶草（Trifolium repense L.）为豆科车轴草属多年生草本植物，喜阳耐阴，具有适应性广、抗热抗寒性强、生长迅速、绿期长等优点，在世界各地作为优良草坪草广泛栽植。近年来，我国北方寒冷地区为了改善城市中草坪的适应性并延长其绿期，人们常将白花三叶草与冷季型禾本科草坪草混合建植草坪[1-2]。研究表明，白花三叶草会侵占禾本科草坪，在禾本科草坪上形成小群落，影响原有的景观效果[1]。白花三叶草入侵禾本科草坪过程中，化感作用（allelopathy）被认为是一个重要因素[3-6]。植物的化感作用是植物通过茎叶挥发、雨水淋溶、根系分泌、残体分解等途径向环境中释放化感物质（allelochemicals），从而对其他植物或自身的生长发育产生促进或抑制作用[6-7]。化感作用广泛存在于自然界中，是生态系统中自然的化學调控现象以及植物适应环境的一种机制。开展化感作用研究对于生态系统中植被形成及演替、植物生长发育调控具有重要意义[8]。研究表明，植物通过化感作用造成细胞伤害进而影响自身或其他植物生长发育过程中，植物细胞内活性氧自由基代谢失衡进而引起自由基积累以及膜脂过氧化，导致膜系统结构、功能受到损伤是重要原因之一[9-11]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等酶类是植物细胞在长期进化过程中形成的防御活性氧自由基毒害的保护酶系统，以维持植物体内活性氧自由基代谢的动态平衡[11-12]。目前，关于白花三叶草对冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株水浸液、挥发物、根系分泌物、腐解液等对受体植物种子萌发、幼苗生长的影响。研究表明，雨水淋溶是植物活体、残体释放化感物质的主要途径之一[13]。本研究以我国北方寒冷地区草坪建植中经常使用的3种冷季型禾本科草坪草即草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草为材料，用蒸馏水浸提白花三叶草植株模拟自然雨水淋溶过程，研究不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子萌发、幼苗生长、SOD等保护酶活性以及丙二醛（MDA）含量的影响，旨在为进一步研究白花三叶草侵占禾本科草坪的原因提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜的生长良好的白花三叶草全株采自东北农业大学校园内。受体植物草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.）种子均购自江苏圣园种子培育基地。
1.2 方法
1.2.1 白花三叶草水浸液的制备
将白花三叶草全株去除杂质，用蒸馏水洗净后用吸水纸吸干水分。取白花三叶草全株25 g，用剪刀剪成长1～2 cm的小段，倒入三角瓶中，加入 250 mL 蒸馏水浸泡48 h（每隔12 h用玻璃棒搅动1次），用布氏漏斗过滤，得到0.100 g/mL白花三叶草水浸液。用蒸馏水稀释该水浸液，分别获得0.005、0.025 g/mL水浸液，4 ℃保存备用。
1.2.2 草坪草种子萌发试验
采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验。首先用0.1%HgCl2溶液对3种草坪草种子消毒10 min，用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3次。分别选择大小均一、籽粒饱满的3种草坪草受体种子各100粒，用消毒过的镊子将其均匀放置于铺有2层滤纸的培养皿中，分别加入不同浓度（0.005、0.025、0.100 g/mL）的白花三叶草水浸液10 mL，以蒸馏水为对照（CK），每处理重复3次。试验期内适量补充蒸馏水以保持培养皿内滤纸湿润。将加有受体种子的培养皿放入人工气候箱中，于25 ℃进行培养，每隔 24 h 观察并记录萌发种子数（胚根或胚轴突破种皮1～2 mm为萌发）。3 d后计算发芽势（GE），7 d后计算发芽率（GR）、发芽势、发芽指数（GI）[6]。7 d后从每个培养皿随机挑选10株草坪草幼苗，用吸水纸吸干水分，用电子天平称量鲜质量，用直尺测量苗高、根长。各指标计算公式如下：
式中：IR为抑制率，%；C为对照值，T为处理值；当IR>0时，表示抑制作用；当IR<0时，表示促进作用。IR绝对值大小代表化感作用强弱[6]。
1.2.3 保护酶活性、丙二醛含量的测定
7 d后从每个培养皿随机挑选若干株草坪草幼苗，用蒸馏水洗净，用滤纸吸干水分，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱内保存待用。采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）法[14]测定SOD活性，以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位。采用过氧化氢还原法[14]测定CAT活性，以1 min 240 nm处吸光度减少0.01定义为1个活性单位。采用愈创木酚法[14]测定POD活性，将1min 470 nm处吸光度增加0.01定义为1个活力单位。参照陈建勋等的方法[15]测定APX活性，以1 min 290 nm处吸光度降低0.01定义为1个酶活性单位。采用硫代巴比妥酸法[14]测定丙二醛含量，每个指标均重复测定3次。 参考文献：
[1]李剑峰，张淑卿，师尚礼，等. 白三叶对禾草草坪的侵占性研究[J]. 现代农业科技，2008（22）：93-94，97.
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[4]税军峰，张玉琳，马永清.白三叶对黑麦草、弯叶画眉草的化感作用初探[J]. 草业科学，2007，24（1）：48-51.
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[13]张 来，张显强. 白三叶提取液对3种植物种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 种子，2011，30（2）：21-25.
[14]高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006.
[15]陈建勋，王晓峰. 植物生理学实验指导[M]. 2版.广州：华南理工大学出版社，2006.
[16]胡中华，刘师汉. 草坪与地被植物[M]. 北京：中国林业出版社，1995.
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