论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨子痫前期患者胎盘组织中Toll样受体4（TLR4）以及核转录因子（NF-κB）表达及意义。方法：选取50例子痫前期患者（轻度子痫前期20例，重度子痫前期30例）作为研究对象，以30例正常晚孕妇女作为正常对照，采用免疫组化及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法测定胎盘组织中TLR4及NF-κB的定位及表达。结果：轻、重度子痫前期患者胎盘组织中TLR4及NF-κB蛋白和mRNA的表达水平均明显高于正常晚孕妇女（P<0.05）。且随着病情加重，两者表达均增强；子痫前期胎盘组织中TLR4和NF-κB的表达呈正相关（P<0.05）。结论：TLR4介导的炎症因子释放可能是导致子痫前期发生的重要原因之一。
【关键词】 子痫前期； 胎盘； TLR4； NF-κB
子痫前期（Preeclampsia，PE）是一种妊娠期特发性疾病，以孕期出现高血压和蛋白尿为主要特征的多器官损害疾病，发病率为3%～14%，是目前产科领域的研究重点之一。本研究通过对子痫前期胎盘组织中Toll样受体4（TLR4）以及核转录因子（NF-κB）表达水平的研究，初步探讨TLR4和NF-κB在子痫前期胎盘组织中表达的意义，并为临床诊断和治疗提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2012年1月-2012年12月在本院产科住院剖宫产分娩的产妇胎盘标本共80例。50例子痫前期（轻度子痫前期20例、重度子痫前期30例）患者为病例组，平均（29.30±2.80）岁，孕周（37.74±1.18）周；30例正常妊娠妇女（因横位、臀位、骨盆狭窄、高龄初产、社会因素等行剖宫产）为对照组，平均（28.10±2.50）岁，孕周（39.06±1.72）周。两组均为单胎初产，均未进入产程。全部研究对象符合以下条件：无胎盘早剥、前置胎盘、母儿血型不合、妊娠期糖尿病等产程并发症，既往体健，两组孕妇月经规则，末次月经清楚。两组孕妇的年龄、孕产次、孕周等比较差异无统计学意义（P>0.05）。子痫前期诊断标准参照乐杰主编《妇产科学》第7版为标准。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与处理 胎盘娩出后立即取胎盘组织中央带母体面至胎儿面2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm，避开梗死及钙化区，经生理盐水充分漂洗后，用10%中性福尔马林溶液固定24 h以上，常规石蜡包埋4 μm连续切片。
1.2.2 免疫组织化学染色 采用免疫组化SP法检查胎盘组织中TRL4和NF-κB p65的表达。主要试剂如第一抗体兔抗人TLR4多克隆抗体购自美USbiological公司，兔抗人NF-κB p65多克隆抗体为美国Neomarker/Labvision公司产品（购自天津津脉公司），TLR4抗体工作浓度1：100，NF-κB p65抗体工作浓度1：50。SP试剂盒及DAB染色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。主要步骤按SP免疫组化试剂盒内说明书进行。用已知的TLR4和NF-κB p65阳性切片做阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作空白对照。TLR4和NF-κB p65以镜像在细胞胞浆和/或胞核内呈棕黄色颗粒即定为阳性表达。随机分别选择10个高倍视野（×100），记数100个细胞，将阳性细胞百分率分为4级，阳性细胞百分率<5%为阴性（-）、5%～25%为弱阳性（+）、25%～50%为中等强度阳性（++）、>50%为强阳性（+++）。
1.2.3 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）
2 结果
2.1 免疫组织化学检测TLR4和NF-κB p65的表达 TLR4在病例组和对照组胎盘组织中的定位部位无差异，阳性染色均呈棕黄色颗粒，主要定位于绒毛合体滋养细胞的胞浆中。镜下观察，子痫前期胎盘着色强度普遍要强于正常妊娠胎盘，TLR4表达呈强阳性，较对照组显著增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。NF-κB在病例组和对照组胎盘组织中的定位部位无差异，阳性染色均呈棕黄色颗粒，主要分布于绒毛合体滋养细胞、绒毛毛细血管内皮细胞的胞浆和/或胞核中。镜下观察，子痫前期胎盘着色强度普遍要强于正常妊娠胎盘，绒毛滋养细胞增生处着色更强，NF-κB表达呈强阳性，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 RT-PCR检测TLR4和NF-κB p65 mRNA的表达水平 TLR4和NF-κB p65 mRNA在正常妊娠组的表达相对较低，在子痫前期组胎盘组织中的表达水平明显升高，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。且子痫前期重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
目前，越来越多的证据显示，慢性感染和炎症被认为是子痫前期发病最重要的后天性和环境因素，Sersam[1]研究表明炎症参与子痫前期的发生发展过程，子痫前期患者的血清和胎盘中的炎性因子水平都明显升高。在子痫前期孕妇的外周血中发现了大量的病原微生物，如细菌、病毒、真菌、肺炎衣原体、巨细胞病毒、腺病毒等。天然免疫系统可通过各种模式识别病原微生物的糖脂类、核酸等分子，引起机体反应，而TLR4/NF-κB信号通路在其中可能起重要作用。Toll样受体4（TLR4）是发现最早的Toll样受体（TLR）家族的重要成员之一，在天然免疫中发挥着重要作用。核转录因子（NF-κB）是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要转录调控因子，能与多种基因启动子中含有的κB序列结合，发挥转录因子作用，激活多种与细胞生长或凋亡相关的细胞因子转录。本研究从蛋白水平和RNA水平探讨TLR4和NF-κB在子痫前期胎盘组织中表达及意义。
Toll样受体是参与天然免疫的一类古老的蛋白质家族，TLRs在细胞信号转导中发挥重要的作用。1997年Medzhitov等[2]发现了第一个存在于人细胞表面的Toll样蛋白，称Toll样受体。目前在人体内已发现多达15种的Toll样受体家族成员，Pineda等[3]研究表明TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-9在子痫前期患者胎盘组织中表达增强。TLR4是TLRs家族中最重要的成员之一。Kim等[4]的实验表明在PE合并早产的胎盘中，TLR4表达量显著高于单纯早产，甚至高于早产合并绒毛膜羊膜炎者。Xie等[5]研究表明PE患者外周血中TLR4转录水平显著增加，早发型者尤为明显，TLR4在胎盘的抗感染免疫中发挥了重要作用。TLR4可识别微生物的细胞膜成分，其被激活后，主要通过髓样分化因子88-依赖性通路激活下游炎症信号，转录调控各种炎症细胞因子、化学因子、抗菌产物及一些共刺激分子，产生多种生物学效应。本研究采用免疫组化和RT-PCR法检测子痫前期患者胎盘组织中TLR4表达情况，结果提示子痫前期患者和正常妊娠孕妇胎盘组织中TLR4均有表达，子痫前期组表达阳性率和表达强度显著高于正常孕妇组，并在正常孕妇组、轻度子痫前期和重度子痫前期中呈递增趋势。 NF-κB是一种细胞内普遍存在的核转录因子，在启动和调控机体免疫应答、炎症反应及细胞增值分化、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用，是多种重要前炎性因子的转录激活因子，其激活可以导致许多下游因子的基因启动，通过对表达过程中最重要的环节即转录水平的调节来发挥功能[6]。NF-κB最常见的存在形式是p50和p65组成的异源二聚体，NF-κB与妊娠的研究显示，NF-κB几乎参与了妊娠的所有过程，并发挥者重要作用[7]。苏雪梅等[8]研究子痫前期患者胎盘组织中NF-κB和肿瘤细胞坏死因子（TNF）-α、NADPH氧化酶、缺氧诱导因子（HIF）-1α、血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1）、血小板源性生长因子（PDGF）等的表达及其相关性，结果显示NF-κB的阳性表达率和表达强度显著升高。本研究结果亦表明NF-κB在子痫前期患者胎盘组织中表达与正常胎盘组织相比明显升高，且随疾病的进展，表达渐增高。
近年来一些研究发现，TLR4通过对病原相关分子模式（PAMPs）进行模式识别，经一系列信号传导分子最终激活NF-κB等信号分子的表达，从而激活免疫及炎症反应[9-11]。从相关性结果分析来看，PE患者胎盘组织中TRL4和NF-κB表达呈正相关。本实验结果证实了TLR4、NF-κB与子痫前期的关系，子痫前期患者胎盘中TLR4及NF-κB表达增加可能是子痫前期发病机制中的关键环节之一，推测可能存在某些内源性因素刺激胎盘组织TLR4，进而激活NF-κB，引发TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，但激活TLR4的这些内源性因素有待深入研究。
参考文献
[1] Sersam L W. Inflammatory markers in pre-eclampsia and related conditions[J]. Int J Gynaecol Obstet， 2009， 105（1）： 69-70.
[2] Medzhitov R， Preston-Hurlburt P， Jr Janeway C A. A human homologue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature， 1997， 388（6640）： 394-397.
[3] Pineda A， Verdin-Terán S L， Camacho A， et al. Expression of toll-like receptor TLR-2， TLR-3， TLR-4 and TLR-9 is increased in placentas from patients with preeclampsia[J]. Arch Med Res， 2011， 42（5）： 382-391.
[4] Kim Y M， Romero R， Oh S Y， et al. Toll-like receptor 4： a potential link between “danger signas”， the innate immune system， and preeclampsia？[J] Am J Obstet Gynecol， 2005， 193（3pt 2）： 921-927.
[5] Xie F， Hu Y， Turvey S E， et al. Toll-like receptors 2 and 4 and the cryopyrin inflammasome in normal pregnancy and pre-eclampsia[J]. BJOG， 2010， 117（1）： 99-108.
[6] Kusunoki T， Sugai M， Gonda H， et al. CpG inhibits IgE class switch recombination through suppression of NF kappa B activity， but not through Id2 or Bcl6[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 328（2）： 499-506.
[7] Torchinsky A， Toder V. To die or not to die： the function of the transcription factor NF-kappaB in embryos exposed to stress[J]. Am J Reprod Immunol， 2004， 51（2）： 138-143.
[8]苏雪梅，付勇，张莉，等.子痫前期患者胎盘组织中核转录因子-κB和肿瘤坏死因子-α的表达及其临床意义[J].中国全科医学，2011，18（14）：1562-1564.
[9]陈芳荣，龚护民，茹美艳. NF–κB在子痫前期中的表达和意义[J].中国妇幼保健，2011，26（24）：3700-3702.
[10]李亮. NF–κB与VCAM-1在子痫前期患者胎盘中的表达及意义[J].中国医药导报，2010，7（7）：150-153.
[11]陈碧霞，何明会. HIF-1α与NF–κB在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达及意义[J]. 中国医药导报，2010，38（1）：74-75.
（收稿日期：2013-11-25） （本文编辑：黄新珍）
【关键词】 子痫前期； 胎盘； TLR4； NF-κB
子痫前期（Preeclampsia，PE）是一种妊娠期特发性疾病，以孕期出现高血压和蛋白尿为主要特征的多器官损害疾病，发病率为3%～14%，是目前产科领域的研究重点之一。本研究通过对子痫前期胎盘组织中Toll样受体4（TLR4）以及核转录因子（NF-κB）表达水平的研究，初步探讨TLR4和NF-κB在子痫前期胎盘组织中表达的意义，并为临床诊断和治疗提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2012年1月-2012年12月在本院产科住院剖宫产分娩的产妇胎盘标本共80例。50例子痫前期（轻度子痫前期20例、重度子痫前期30例）患者为病例组，平均（29.30±2.80）岁，孕周（37.74±1.18）周；30例正常妊娠妇女（因横位、臀位、骨盆狭窄、高龄初产、社会因素等行剖宫产）为对照组，平均（28.10±2.50）岁，孕周（39.06±1.72）周。两组均为单胎初产，均未进入产程。全部研究对象符合以下条件：无胎盘早剥、前置胎盘、母儿血型不合、妊娠期糖尿病等产程并发症，既往体健，两组孕妇月经规则，末次月经清楚。两组孕妇的年龄、孕产次、孕周等比较差异无统计学意义（P>0.05）。子痫前期诊断标准参照乐杰主编《妇产科学》第7版为标准。
1.2 方法
1.2.1 标本采集与处理 胎盘娩出后立即取胎盘组织中央带母体面至胎儿面2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm，避开梗死及钙化区，经生理盐水充分漂洗后，用10%中性福尔马林溶液固定24 h以上，常规石蜡包埋4 μm连续切片。
1.2.2 免疫组织化学染色 采用免疫组化SP法检查胎盘组织中TRL4和NF-κB p65的表达。主要试剂如第一抗体兔抗人TLR4多克隆抗体购自美USbiological公司，兔抗人NF-κB p65多克隆抗体为美国Neomarker/Labvision公司产品（购自天津津脉公司），TLR4抗体工作浓度1：100，NF-κB p65抗体工作浓度1：50。SP试剂盒及DAB染色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。主要步骤按SP免疫组化试剂盒内说明书进行。用已知的TLR4和NF-κB p65阳性切片做阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作空白对照。TLR4和NF-κB p65以镜像在细胞胞浆和/或胞核内呈棕黄色颗粒即定为阳性表达。随机分别选择10个高倍视野（×100），记数100个细胞，将阳性细胞百分率分为4级，阳性细胞百分率<5%为阴性（-）、5%～25%为弱阳性（+）、25%～50%为中等强度阳性（++）、>50%为强阳性（+++）。
1.2.3 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）
2 结果
2.1 免疫组织化学检测TLR4和NF-κB p65的表达 TLR4在病例组和对照组胎盘组织中的定位部位无差异，阳性染色均呈棕黄色颗粒，主要定位于绒毛合体滋养细胞的胞浆中。镜下观察，子痫前期胎盘着色强度普遍要强于正常妊娠胎盘，TLR4表达呈强阳性，较对照组显著增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。NF-κB在病例组和对照组胎盘组织中的定位部位无差异，阳性染色均呈棕黄色颗粒，主要分布于绒毛合体滋养细胞、绒毛毛细血管内皮细胞的胞浆和/或胞核中。镜下观察，子痫前期胎盘着色强度普遍要强于正常妊娠胎盘，绒毛滋养细胞增生处着色更强，NF-κB表达呈强阳性，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 RT-PCR检测TLR4和NF-κB p65 mRNA的表达水平 TLR4和NF-κB p65 mRNA在正常妊娠组的表达相对较低，在子痫前期组胎盘组织中的表达水平明显升高，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。且子痫前期重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
目前，越来越多的证据显示，慢性感染和炎症被认为是子痫前期发病最重要的后天性和环境因素，Sersam[1]研究表明炎症参与子痫前期的发生发展过程，子痫前期患者的血清和胎盘中的炎性因子水平都明显升高。在子痫前期孕妇的外周血中发现了大量的病原微生物，如细菌、病毒、真菌、肺炎衣原体、巨细胞病毒、腺病毒等。天然免疫系统可通过各种模式识别病原微生物的糖脂类、核酸等分子，引起机体反应，而TLR4/NF-κB信号通路在其中可能起重要作用。Toll样受体4（TLR4）是发现最早的Toll样受体（TLR）家族的重要成员之一，在天然免疫中发挥着重要作用。核转录因子（NF-κB）是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要转录调控因子，能与多种基因启动子中含有的κB序列结合，发挥转录因子作用，激活多种与细胞生长或凋亡相关的细胞因子转录。本研究从蛋白水平和RNA水平探讨TLR4和NF-κB在子痫前期胎盘组织中表达及意义。
Toll样受体是参与天然免疫的一类古老的蛋白质家族，TLRs在细胞信号转导中发挥重要的作用。1997年Medzhitov等[2]发现了第一个存在于人细胞表面的Toll样蛋白，称Toll样受体。目前在人体内已发现多达15种的Toll样受体家族成员，Pineda等[3]研究表明TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-9在子痫前期患者胎盘组织中表达增强。TLR4是TLRs家族中最重要的成员之一。Kim等[4]的实验表明在PE合并早产的胎盘中，TLR4表达量显著高于单纯早产，甚至高于早产合并绒毛膜羊膜炎者。Xie等[5]研究表明PE患者外周血中TLR4转录水平显著增加，早发型者尤为明显，TLR4在胎盘的抗感染免疫中发挥了重要作用。TLR4可识别微生物的细胞膜成分，其被激活后，主要通过髓样分化因子88-依赖性通路激活下游炎症信号，转录调控各种炎症细胞因子、化学因子、抗菌产物及一些共刺激分子，产生多种生物学效应。本研究采用免疫组化和RT-PCR法检测子痫前期患者胎盘组织中TLR4表达情况，结果提示子痫前期患者和正常妊娠孕妇胎盘组织中TLR4均有表达，子痫前期组表达阳性率和表达强度显著高于正常孕妇组，并在正常孕妇组、轻度子痫前期和重度子痫前期中呈递增趋势。 NF-κB是一种细胞内普遍存在的核转录因子，在启动和调控机体免疫应答、炎症反应及细胞增值分化、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用，是多种重要前炎性因子的转录激活因子，其激活可以导致许多下游因子的基因启动，通过对表达过程中最重要的环节即转录水平的调节来发挥功能[6]。NF-κB最常见的存在形式是p50和p65组成的异源二聚体，NF-κB与妊娠的研究显示，NF-κB几乎参与了妊娠的所有过程，并发挥者重要作用[7]。苏雪梅等[8]研究子痫前期患者胎盘组织中NF-κB和肿瘤细胞坏死因子（TNF）-α、NADPH氧化酶、缺氧诱导因子（HIF）-1α、血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1）、血小板源性生长因子（PDGF）等的表达及其相关性，结果显示NF-κB的阳性表达率和表达强度显著升高。本研究结果亦表明NF-κB在子痫前期患者胎盘组织中表达与正常胎盘组织相比明显升高，且随疾病的进展，表达渐增高。
近年来一些研究发现，TLR4通过对病原相关分子模式（PAMPs）进行模式识别，经一系列信号传导分子最终激活NF-κB等信号分子的表达，从而激活免疫及炎症反应[9-11]。从相关性结果分析来看，PE患者胎盘组织中TRL4和NF-κB表达呈正相关。本实验结果证实了TLR4、NF-κB与子痫前期的关系，子痫前期患者胎盘中TLR4及NF-κB表达增加可能是子痫前期发病机制中的关键环节之一，推测可能存在某些内源性因素刺激胎盘组织TLR4，进而激活NF-κB，引发TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，但激活TLR4的这些内源性因素有待深入研究。
参考文献
[1] Sersam L W. Inflammatory markers in pre-eclampsia and related conditions[J]. Int J Gynaecol Obstet， 2009， 105（1）： 69-70.
[2] Medzhitov R， Preston-Hurlburt P， Jr Janeway C A. A human homologue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature， 1997， 388（6640）： 394-397.
[3] Pineda A， Verdin-Terán S L， Camacho A， et al. Expression of toll-like receptor TLR-2， TLR-3， TLR-4 and TLR-9 is increased in placentas from patients with preeclampsia[J]. Arch Med Res， 2011， 42（5）： 382-391.
[4] Kim Y M， Romero R， Oh S Y， et al. Toll-like receptor 4： a potential link between “danger signas”， the innate immune system， and preeclampsia？[J] Am J Obstet Gynecol， 2005， 193（3pt 2）： 921-927.
[5] Xie F， Hu Y， Turvey S E， et al. Toll-like receptors 2 and 4 and the cryopyrin inflammasome in normal pregnancy and pre-eclampsia[J]. BJOG， 2010， 117（1）： 99-108.
[6] Kusunoki T， Sugai M， Gonda H， et al. CpG inhibits IgE class switch recombination through suppression of NF kappa B activity， but not through Id2 or Bcl6[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 328（2）： 499-506.
[7] Torchinsky A， Toder V. To die or not to die： the function of the transcription factor NF-kappaB in embryos exposed to stress[J]. Am J Reprod Immunol， 2004， 51（2）： 138-143.
[8]苏雪梅，付勇，张莉，等.子痫前期患者胎盘组织中核转录因子-κB和肿瘤坏死因子-α的表达及其临床意义[J].中国全科医学，2011，18（14）：1562-1564.
[9]陈芳荣，龚护民，茹美艳. NF–κB在子痫前期中的表达和意义[J].中国妇幼保健，2011，26（24）：3700-3702.
[10]李亮. NF–κB与VCAM-1在子痫前期患者胎盘中的表达及意义[J].中国医药导报，2010，7（7）：150-153.
[11]陈碧霞，何明会. HIF-1α与NF–κB在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达及意义[J]. 中国医药导报，2010，38（1）：74-75.
（收稿日期：2013-11-25） （本文编辑：黄新珍）