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【摘要】对两种品系小鼠DBA/1小鼠和FVB/NJ分别采用单次给予高浓度的完全弗氏佐剂（CFA）和胶原的乳化剂;或首次免疫给予低浓度的完全弗氏佐剂（CFA）和胶原的乳化剂，第二次给予不完全弗氏佐剂（IFA）和胶原的乳化剂增强免疫这两种方法来建立II型胶原诱导性关节炎模型。通过观察其外观、关节评分来评估模型的成功建立，并观察两种品系小鼠在此模型中的差异。结果显示：采用两次免疫的效果更好，且DBA/1小鼠在此模型中成功率为90%-100%;而FVB/NJ小鼠在两种造模方法中成功率均为0%。
【关键词】胶原诱导型关节炎;完全弗氏佐剂;不完全弗氏佐剂;牛II型胶原;乳化;DBA/1;FVB/NJ
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA） 是一种种以慢性关节滑膜炎症为特征的器官特异性自身免疫系统疾病。在发病关节腔内有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润。主要的病理特征是关节滑膜及周围结缔组织异常增生、关节软骨进行性破坏。患者不仅具有免疫功能紊乱的特征更严重的后果在于患者最终会发生以四肢关节为主的全身大小关节严重损伤，致残率高达15%，而目前RA发病机制还尚未完全明确。为了进一步研究其发病机制，揭示有效的临床干预性治疗，建立一个更接近RA的动物模型显得尤为重要。
CIA（Collagen-induced arthritis）的小鼠模型中显示与人RA具有相同的免疫学和病理学特征，是较为理想的动物模型。但不同品系的小鼠存在对CIA的遗传易感性，在成模率上有很大的差异，研究发现，CIA受多基因控制，主要与 MHC-II 类分子有关。本次实验选用对CIA高反应的DBA/1小鼠和基因工程中常用到的FVB/NJ小鼠来测试两种模型方法，观察这两种品系在不同模型中的成模率。要想成功地诱发关节炎，并能保证有足够的发病率和安全性，一些实验材料、方法以及细节是必须要去摸索的。本文介绍了成功复制小鼠CIA模型的具体方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8-12周龄，SPF级，DBA/1雌鼠购自维通利华，FVB/NJ雌鼠由上海复旦大学发育生物学研究所提供，均饲养于上海复旦大学发育生物学研究所SPF级屏障环境内。在正式实验前，小鼠需在环境内适应至少一周。每种品系小鼠随机分为3组，每组10只。
1.1.2 主要試剂和仪器
牛II型胶原（2mg/ml溶于0.05M醋酸）、完全弗氏佐剂（5mlx2mg/ml）、完全弗氏佐剂（5mlx4mg/ml）、不完全弗氏佐剂（均为Chondrex公司产品）;PBS缓冲盐溶液（Corning公司产品）;涡流振荡仪（Fisher Scientific）;高通量组织研磨仪（上海万柏生物）;小鼠固定器（北京翼诺泰科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试剂乳化方法
在超净工作台内将直径为2mm的钢珠浸泡与无水乙醇中15分钟后取出，吸水纸吸干多余乙醇，将钢珠置于2ml无菌离心管中。取0.4ml 完全弗氏佐剂（2mg/ml或4mg/ml）加入离心管，再将0.4ml牛II型胶原滴入完全弗氏佐剂中，即灭活结核分歧杆菌的终浓度分别为1mg/ml和2mg/ml，牛II型胶原的终浓度均为1mg/ml。因为钢珠在乳化剂中弹跳范围有限，每管总体积不得超过1ml，这里推荐总体积为0.8ml。涡流振荡仪混匀后，置于冰上。将离心管插入提前在-20度冰箱里预冷的模块，盖上盖子，65Hz，研磨3分钟后取出置于冰上冷却3～4分钟。重复此步骤3-4次后置于冰上待注射。取少量乳化好的乳化剂于1ml注射器中，滴入水中成固体团块，不消散即为稳定的乳化液。
试剂的乳化是决定造模成功与否的关键步骤，这里不建议用超声的方式进行乳化，因为超声会将胶原切割成碎片而导致造模失败。
1.2.2 首次免疫
将小鼠置于固定器内，露出尾巴。用70%酒精擦拭消毒注射部位，在距离尾巴根部25mm处进针，皮下向前插入针头7-10mm，注意避开血管且确保针头可见，如意外插进血管注射会造成栓塞而导致小鼠死亡。每只小鼠缓慢注射100ul乳化剂，注射完后将针头停留在注射部位10-15秒，再用手轻轻按住注射部位缓慢拔出针头，以防漏液。注射每只小鼠之前要用灭菌纸擦拭针头，以防针头处漏液，且确保每只小鼠一针打进，不可两处或多处注射，会造成乳化剂从其他针眼处漏出。乳化剂全程置于冰上，且整个注射时间控制在40分钟内，以保证乳化剂的稳定性。对照组给予100ulPBS尾部皮下注射。
1.2.3 增强免疫
对于首次已给予高浓度完全弗氏佐剂（终浓度为2mg/ml）与胶原（终浓度为1mg/ml）的乳化剂的组别不再给予第二次增强免疫。对于首次给予低浓度完全弗氏佐剂（终浓度为1mg/ml）与胶原（终浓度为1mg/ml）的乳化剂的组别须在首次免疫后的第21天进行第二针增强免疫，试剂乳化方法同前，将完全弗氏佐剂（CFA）换成不完全弗氏佐剂（IFA）即可，胶原的终浓度仍为1mg/ml。注射部位须为首次注射部位同侧，距离首次注射部位（靠近小鼠头部方向）数毫米处。注射方法同前，每只小鼠注射100ul不完全弗氏佐剂与胶原的乳化剂。对照组再次给予100ulPBS尾部皮下注射。
1.2.4 CIA模型关节评分
小鼠关节评分采用5级评分法：0分：正常;1分：一只脚趾发炎肿胀;2分：不止一只脚趾（但不是整个爪子）发炎和肿胀，或整个爪子轻度肿胀;3分：整个爪子严重发炎肿胀;4分：包括踝关节在内全部足爪严重发炎、肿胀或僵硬，小鼠不能负重，也不能抓住笼子顶部的铁丝网（图1）。关节评分用于评估各组小鼠的发病情况并进行统计学分析。
1.3 统计学处理
数据使用Prism（Graphpad）软件进行分析。使用配对t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示具有高度统计学意义。 2 结果
2.1 关节评分曲线及关节炎发病症状
首次免疫后第21天开始每周观察各组小鼠关节发病情况，并依据评分标准进行评分结果。DBA/1小鼠2mg/ml完全弗氏佐剂加膠原单次免疫组和1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组均从第28天开始出现关节炎发病迹象，随着时间的推移，症状愈加严重，达到高峰后可持续一段时间，之后症状开始逐渐减轻。2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组在第49天达到高峰，可持续21天，之后症状开始减轻;1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组则在第56天达到高峰，可持续7天，之后症状开始减轻（图2）。而FVB/NJ小鼠在两种模型组中均未出现关节炎症状（图3）。观察首次免疫后第49天各组小鼠关节炎发病情况，DBA/1小鼠1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组最严重，2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组次之，与对照组比较有明显的关节肿胀症状;FVB/NJ小鼠两组模型组与对照组比较无差异（图4）。
2.2 模型成功率
以高峰期关节评分达到8-12分作为模型成功标准，统计各组模型成功率：在DBA/1小鼠中1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组模型成功率为92.5%，2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组为47.5%;FVB/NJ小鼠在两种造模方法中成功率均为0%（图5）。
3 结论
DBA/1小鼠在首次免疫给予低浓度的完全弗氏佐剂（CFA）和胶原的乳化剂，第二次给予不完全弗氏佐剂（IFA）和胶原的乳化剂增强免疫的模型效果明显优于高浓度完全弗氏佐剂（CFA）加胶原单次免疫组。首次免疫后28-35天逐渐成模，并在49-63天模型达到高峰，模型成功率可达90%-100%。而FVB/NJ小鼠的在此模型中成功率为0%，有研究指出尽管FVB/NJ小鼠携带一种诱导小鼠关节炎的易感MHC单倍型（H2q），但它对CIA具有抗性。本次实验结果也证明了FVB/NJ小鼠不能形成CIA模型。
参考文献：
[1] 潘晓夫，黄卓春，王兰兰. 类风湿性关节炎疾病相关的特异性血清蛋白标志物[J]. 免疫学杂志，2009 25 （5）：563-571.
[2] 赵蓉，许荣，周晓薇，等.抗胶原II功能域抗体诱导的RA样小鼠模型的建立及其免疫病理学指标分析[J].现代免疫学，2013，33（1）：6-12.
[3] ES Cathcart， KC Hayes， WA Gonnerman， AA Lazzari， C Franzblau. Experimental arthritis in a nonhuman primate. I. Induction by bovine type II collagen. Lab Invest 54：26-31， 1986.
[4] WC Watson， AS Townes. Genetic susceptibility to murine collagen II autoimmune arthritis. Proposed relationship to the IgG2 autoantibody subclass response， complement C5， major histocompatability complex （MHC） and non-MHC loci. [J] Exp Med 162：1878-1891， 1985.
[5] PH Wooley， et al. Type II collagen-induced arthritis in mice. IV. Variations in immunogenetic regulation provide evidence for multiple arthritogenic epitopes on the collagen molecule. [J] Immunol 135：2443-2451， 1985.
[6] K Terato， et al. Collagen-induced arthritis in mice. Localiza- tion of an arthritogenic determinant to a fragment of the type II collagen molecule. [J ] Exp Med 162：637-646， 1985.
[7] David D Brand， Kary A Latham ，Edward F Rosloniec. Collagen-induced arthritis. [J] Nature protocols （2007） 2：1269-1275.
[8] Gamal E. Osman 7 Mark C. Hannibal 7 Jon P. Anderson et al. FVB/N （H2q） mouse is resistant to arthritis induction and exhibits a genomic deletion of T-cell receptor V beta gene segments. [J]Immunogenetics （1999） 49：851–859.
【关键词】胶原诱导型关节炎;完全弗氏佐剂;不完全弗氏佐剂;牛II型胶原;乳化;DBA/1;FVB/NJ
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA） 是一种种以慢性关节滑膜炎症为特征的器官特异性自身免疫系统疾病。在发病关节腔内有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润。主要的病理特征是关节滑膜及周围结缔组织异常增生、关节软骨进行性破坏。患者不仅具有免疫功能紊乱的特征更严重的后果在于患者最终会发生以四肢关节为主的全身大小关节严重损伤，致残率高达15%，而目前RA发病机制还尚未完全明确。为了进一步研究其发病机制，揭示有效的临床干预性治疗，建立一个更接近RA的动物模型显得尤为重要。
CIA（Collagen-induced arthritis）的小鼠模型中显示与人RA具有相同的免疫学和病理学特征，是较为理想的动物模型。但不同品系的小鼠存在对CIA的遗传易感性，在成模率上有很大的差异，研究发现，CIA受多基因控制，主要与 MHC-II 类分子有关。本次实验选用对CIA高反应的DBA/1小鼠和基因工程中常用到的FVB/NJ小鼠来测试两种模型方法，观察这两种品系在不同模型中的成模率。要想成功地诱发关节炎，并能保证有足够的发病率和安全性，一些实验材料、方法以及细节是必须要去摸索的。本文介绍了成功复制小鼠CIA模型的具体方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
8-12周龄，SPF级，DBA/1雌鼠购自维通利华，FVB/NJ雌鼠由上海复旦大学发育生物学研究所提供，均饲养于上海复旦大学发育生物学研究所SPF级屏障环境内。在正式实验前，小鼠需在环境内适应至少一周。每种品系小鼠随机分为3组，每组10只。
1.1.2 主要試剂和仪器
牛II型胶原（2mg/ml溶于0.05M醋酸）、完全弗氏佐剂（5mlx2mg/ml）、完全弗氏佐剂（5mlx4mg/ml）、不完全弗氏佐剂（均为Chondrex公司产品）;PBS缓冲盐溶液（Corning公司产品）;涡流振荡仪（Fisher Scientific）;高通量组织研磨仪（上海万柏生物）;小鼠固定器（北京翼诺泰科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试剂乳化方法
在超净工作台内将直径为2mm的钢珠浸泡与无水乙醇中15分钟后取出，吸水纸吸干多余乙醇，将钢珠置于2ml无菌离心管中。取0.4ml 完全弗氏佐剂（2mg/ml或4mg/ml）加入离心管，再将0.4ml牛II型胶原滴入完全弗氏佐剂中，即灭活结核分歧杆菌的终浓度分别为1mg/ml和2mg/ml，牛II型胶原的终浓度均为1mg/ml。因为钢珠在乳化剂中弹跳范围有限，每管总体积不得超过1ml，这里推荐总体积为0.8ml。涡流振荡仪混匀后，置于冰上。将离心管插入提前在-20度冰箱里预冷的模块，盖上盖子，65Hz，研磨3分钟后取出置于冰上冷却3～4分钟。重复此步骤3-4次后置于冰上待注射。取少量乳化好的乳化剂于1ml注射器中，滴入水中成固体团块，不消散即为稳定的乳化液。
试剂的乳化是决定造模成功与否的关键步骤，这里不建议用超声的方式进行乳化，因为超声会将胶原切割成碎片而导致造模失败。
1.2.2 首次免疫
将小鼠置于固定器内，露出尾巴。用70%酒精擦拭消毒注射部位，在距离尾巴根部25mm处进针，皮下向前插入针头7-10mm，注意避开血管且确保针头可见，如意外插进血管注射会造成栓塞而导致小鼠死亡。每只小鼠缓慢注射100ul乳化剂，注射完后将针头停留在注射部位10-15秒，再用手轻轻按住注射部位缓慢拔出针头，以防漏液。注射每只小鼠之前要用灭菌纸擦拭针头，以防针头处漏液，且确保每只小鼠一针打进，不可两处或多处注射，会造成乳化剂从其他针眼处漏出。乳化剂全程置于冰上，且整个注射时间控制在40分钟内，以保证乳化剂的稳定性。对照组给予100ulPBS尾部皮下注射。
1.2.3 增强免疫
对于首次已给予高浓度完全弗氏佐剂（终浓度为2mg/ml）与胶原（终浓度为1mg/ml）的乳化剂的组别不再给予第二次增强免疫。对于首次给予低浓度完全弗氏佐剂（终浓度为1mg/ml）与胶原（终浓度为1mg/ml）的乳化剂的组别须在首次免疫后的第21天进行第二针增强免疫，试剂乳化方法同前，将完全弗氏佐剂（CFA）换成不完全弗氏佐剂（IFA）即可，胶原的终浓度仍为1mg/ml。注射部位须为首次注射部位同侧，距离首次注射部位（靠近小鼠头部方向）数毫米处。注射方法同前，每只小鼠注射100ul不完全弗氏佐剂与胶原的乳化剂。对照组再次给予100ulPBS尾部皮下注射。
1.2.4 CIA模型关节评分
小鼠关节评分采用5级评分法：0分：正常;1分：一只脚趾发炎肿胀;2分：不止一只脚趾（但不是整个爪子）发炎和肿胀，或整个爪子轻度肿胀;3分：整个爪子严重发炎肿胀;4分：包括踝关节在内全部足爪严重发炎、肿胀或僵硬，小鼠不能负重，也不能抓住笼子顶部的铁丝网（图1）。关节评分用于评估各组小鼠的发病情况并进行统计学分析。
1.3 统计学处理
数据使用Prism（Graphpad）软件进行分析。使用配对t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示具有高度统计学意义。 2 结果
2.1 关节评分曲线及关节炎发病症状
首次免疫后第21天开始每周观察各组小鼠关节发病情况，并依据评分标准进行评分结果。DBA/1小鼠2mg/ml完全弗氏佐剂加膠原单次免疫组和1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组均从第28天开始出现关节炎发病迹象，随着时间的推移，症状愈加严重，达到高峰后可持续一段时间，之后症状开始逐渐减轻。2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组在第49天达到高峰，可持续21天，之后症状开始减轻;1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组则在第56天达到高峰，可持续7天，之后症状开始减轻（图2）。而FVB/NJ小鼠在两种模型组中均未出现关节炎症状（图3）。观察首次免疫后第49天各组小鼠关节炎发病情况，DBA/1小鼠1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组最严重，2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组次之，与对照组比较有明显的关节肿胀症状;FVB/NJ小鼠两组模型组与对照组比较无差异（图4）。
2.2 模型成功率
以高峰期关节评分达到8-12分作为模型成功标准，统计各组模型成功率：在DBA/1小鼠中1mg/ml 完全弗氏佐剂加胶原合并不完全弗氏佐剂加胶原增强免疫组模型成功率为92.5%，2mg/ml完全弗氏佐剂加胶原单次免疫组为47.5%;FVB/NJ小鼠在两种造模方法中成功率均为0%（图5）。
3 结论
DBA/1小鼠在首次免疫给予低浓度的完全弗氏佐剂（CFA）和胶原的乳化剂，第二次给予不完全弗氏佐剂（IFA）和胶原的乳化剂增强免疫的模型效果明显优于高浓度完全弗氏佐剂（CFA）加胶原单次免疫组。首次免疫后28-35天逐渐成模，并在49-63天模型达到高峰，模型成功率可达90%-100%。而FVB/NJ小鼠的在此模型中成功率为0%，有研究指出尽管FVB/NJ小鼠携带一种诱导小鼠关节炎的易感MHC单倍型（H2q），但它对CIA具有抗性。本次实验结果也证明了FVB/NJ小鼠不能形成CIA模型。
参考文献：
[1] 潘晓夫，黄卓春，王兰兰. 类风湿性关节炎疾病相关的特异性血清蛋白标志物[J]. 免疫学杂志，2009 25 （5）：563-571.
[2] 赵蓉，许荣，周晓薇，等.抗胶原II功能域抗体诱导的RA样小鼠模型的建立及其免疫病理学指标分析[J].现代免疫学，2013，33（1）：6-12.
[3] ES Cathcart， KC Hayes， WA Gonnerman， AA Lazzari， C Franzblau. Experimental arthritis in a nonhuman primate. I. Induction by bovine type II collagen. Lab Invest 54：26-31， 1986.
[4] WC Watson， AS Townes. Genetic susceptibility to murine collagen II autoimmune arthritis. Proposed relationship to the IgG2 autoantibody subclass response， complement C5， major histocompatability complex （MHC） and non-MHC loci. [J] Exp Med 162：1878-1891， 1985.
[5] PH Wooley， et al. Type II collagen-induced arthritis in mice. IV. Variations in immunogenetic regulation provide evidence for multiple arthritogenic epitopes on the collagen molecule. [J] Immunol 135：2443-2451， 1985.
[6] K Terato， et al. Collagen-induced arthritis in mice. Localiza- tion of an arthritogenic determinant to a fragment of the type II collagen molecule. [J ] Exp Med 162：637-646， 1985.
[7] David D Brand， Kary A Latham ，Edward F Rosloniec. Collagen-induced arthritis. [J] Nature protocols （2007） 2：1269-1275.
[8] Gamal E. Osman 7 Mark C. Hannibal 7 Jon P. Anderson et al. FVB/N （H2q） mouse is resistant to arthritis induction and exhibits a genomic deletion of T-cell receptor V beta gene segments. [J]Immunogenetics （1999） 49：851–859.