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生产优质鸡蛋必须增强对蛋鸡生产性能和蛋壳质量影响因素的了解，因为蛋壳质量缺陷可导致蛋鸡行业的显著损失。据估计，因蛋壳质量相关问题导致的鸡蛋损失率达10 %～15 %。矿物质营养和添加剂等方法被认为可改善蛋壳质量。
蛋鸡日粮的矿物质大多数是无机来源，如氧化物、硫酸盐、碳酸盐和磷酸盐，有机矿物元素也已进入市场，它们更容易为家禽吸收和保持，减少微量元素排放，从而减少潜在的环境污染。
AAFCO在2001提出了有机矿物质的概念，金属离子与有机化合物分子通过化学键连接，形成独特的结构，不但稳定性较好，同时也具有较高的生物利用率。但由于微量元素来源和添加水平不同，导致家禽日粮中添加有机微量元素的实际效果仍存在争议。
微量元素是蛋鸡日粮中必需的营养素，它们参与包括骨骼和蛋壳生成在内的正常生长发育过程。锌是碳酸酐酶抑制剂的一种辅助因子，参与蛋壳形成；锰是参与糖胺聚糖和糖蛋白合成的酶激活剂，有助于蛋壳有机基质的形成；铜是赖氨酰氧化酶的组成部分，对蛋壳膜中胶原蛋白的生成很重要。
蛋壳包括有机成分和无机成分。有机成分由壳膜、乳锥、蛋壳基质以及液膜组成。无机成分由碳酸钙晶体组成，从里到外的蛋壳层包括乳头层（内）、海绵层（中）和表面晶体层。蛋壳结构在一定程度上是因晶体生长期间相邻晶核对空间竞争所致。微量元素是蛋壳合成中的酶成分，并在蛋壳形成期间直接与钙晶体相互作用，从而影响蛋壳质量。不过，据文献报道，添加有机矿物质仍然存在争议。部分研究人员发现，有机和无机来源的锌、锰和铜对鸡蛋质量的影响没有差异。
微量元素锌、锰和铜会影响蛋壳的有机基质，从而影响到蛋壳的机械性能。构成有机基质的壳膜可在蛋壳内形成纤维强化网，有助于防止鸡蛋破碎。与蛋壳抗破碎有关的问题非常复杂，可能与有机和无机成分之间的相互作用有关。因此，对蛋壳进行超微结构评估可更深入了解蛋壳组织。
本研究的目标是评估日粮添加无机和有机微量元素对47～62周龄产蛋母鸡生产性能、蛋壳质量以及蛋壳超微结构的影响。
1 材料与方法
1.1 蛋鸡
试验在巴西巴拉那马林加州立大学试验农场进行。360羽47～62周龄的海兰W36蛋鸡饲养在集蛋笼（1 m×0.5 m）中，每重复为一笼8羽母鸡。蛋鸡自由采食和饮水，在开始试验前按照体重和产蛋量进行标准化（即将饲养蛋鸡按体重调整在平均体重的5 %SD范围）。只选择产蛋的母鸡，并进行14 d的适应。每天光照17 h，逐日记录舍内最低和最高平均温度，分别为17.4 ℃和26.5 ℃，相对湿度平均为37.6 %（最低）和84.6 %（最高）。
1.2 试验日粮
试验采用完全随机化设计，9个处理、5个重复，每个重复8羽蛋鸡。无机微量元素来源为硫酸锰（31 %）和硫酸锌（94 %）、氧化铜（24 %）。有机微量元素来源为锌蛋白盐（150 000 mg/kg）、锰蛋白盐（150 000 mg/kg）和铜蛋白盐（100 000 mg/kg）。处理分组见表1，对照日粮不添加锰、锌和铜。试验日粮根据产蛋阶段的现有行业标准配制。饲料组分比例和试验日粮计算值见表2。基础日粮在垂直混合机中混合，然后与不同来源的适量矿物质混合，获得试验日粮。
2 生产性能和蛋壳质量
以28 d为一个间隔记录日采食量（g/羽/d）、饲料转化率（千克饲料/打鸡蛋和千克饲料/千克鸡蛋）、产蛋率（%）、蛋损率（%）。日产蛋量以产蛋率（%）乘以平均蛋重（g）再除以100计算，变量均以每个重复均值表示（n=8羽蛋鸡）。蛋损（%）包括破损、裂纹、有孔或薄壳蛋。
在每个28 d间隔结束时，连续3 d评估如下指标：平均蛋重、蛋白高度、蛋比重、蛋壳质量比和蛋壳厚度。对每个试验单元中所有完好的鸡蛋逐个称重（0.01 g），然后采用盐水漂浮法测定蛋比重。在测定蛋比重后，每个试验单元取3枚鸡蛋样品，测定蛋白高度，并计算哈氏单位。
洗涤蛋壳并在室温下干燥72 h，使用精密电子天平称重（0.001 g）。计算蛋壳质量比。在称量蛋壳后，使用数字式千分仪测定每个蛋壳中央部位3个点的蛋壳厚度。在每个间隔期第28天，每个重复取3枚鸡蛋，使用质构仪测定蛋壳抗压能力。
3 蛋壳超微结构
在试验的最后一天（62周龄），每个重复随机收集2枚鸡蛋。打破鸡蛋并洗涤蛋壳，分离并保存赤道部位样本。将样品浸入6 %的次氯酸钠、4.12 %氯化钠和0.15 %氢氧化钠溶液中，除去壳膜。然后按照Radwan等介绍的方法在水中洗涤蛋壳，室温干燥48 h。每个鸡蛋制备2个蛋壳样本（0.5 m2），使用岛津SS-550进行扫描电镜分析。其中一个样本用于分析蛋壳内表面，另外一个用于评估横截面。将样本粘到铝制支撑物上，以金进行金属化，然后在电子显微镜下进行分析。对于内表面分析，每个样本放大50倍，得到乳头数/mm2和3个扫描图像。
蛋壳横断面分析中测定海绵层厚度（μm），乳头层厚度、以及总厚度（海绵层 乳头层）。计算每层厚度相对于总厚度值的比例。
4 统计分析
采用SAS统计软件进行统计分析。使用回归法分析微量元素添加剂量和来源的影响。
5 结果与讨论
蛋鸡日粮中添加不同剂量的锰、锌和铜，其生产性能指标和蛋品质回归分析结果见表3。微量元素来源和添加水平之间没有互作（P>0.05）。产蛋周期与微量元素来源之间、与添加量之间也没有相互影响。添加微量元素锰、锌和铜对产蛋性能、采食量、饲料转化率、蛋比重以及哈氏单位没有影响。
蛋重与锰、铜和锌含量呈现二次效应（P<0.05），但与来源无关。蛋壳厚度也为二次效应，取决于微量元素的添加水平（P<0.05）。微量元素来源对蛋壳厚度具有明显影响，有机微量元素具有更大的蛋壳厚度。微量元素蛋白盐是通过蛋白质水解获得，水解产物中含有氨基酸混合物和长度不等的小肽。以这种方式形成稳定的螯合物可保护微量元素在消化过程中不发生化学反应，通过胃肠道到达吸收部位期间保持这些物质的溶解性。因此无机和有机形式的微量元素合并使用可能更具优势。 通过肽和氨基酸途径吸收并运输微量元素，可增加消化期间的稳定性，提高生物利用率提高。不过尽管有机微量元素吸收增加，但在本研究中未观察到对生产性能的影响，而是观察到可能对蛋壳形成具有直接影响。锰、锌和铜添加量增加使得蛋损率线性下降（P<0.01）、蛋壳强度线性增加（P<0.05），表明形成的蛋壳质量更佳。
无论是有机还是无机来源的微量元素均可提高蛋壳强度，这也可能与蛋损下降有关系。日粮微量元素含量增加应与蛋壳膜形成有关。铜可改善壳膜，锌和锰参与蛋壳有机和无机化学反应，从而具有更优质的蛋壳。Maciel等也观察到这种影响，他们发现，蛋鸡日粮添加50 mg/kg的有机锌、锰和铜，蛋损率下降。蛋损率下降、蛋壳抗破碎性能增强是商品化蛋鸡业中具有经济意义的理想特性。本研究与Ludeen的研究结果一致，他们观察到饲喂锌和锰蛋白盐的60周龄蛋鸡抗碎裂性改善。Paik也报道有机锌和锰可改善蛋壳强度，锌对形成蛋壳必需的碳酸酐酶合成具有影响。
62周龄蛋鸡饲喂2种来源微量元素日粮的蛋壳超微结构回归分析结果见表4。添加微量元素的来源和含量之间没有相互作用（P>0.05）。在商品化蛋鸡日粮中添加锰、锌和铜对蛋壳乳头层厚度没有影响（P>0.05）。
微量元素锰、锌和铜含量会增加使蛋壳厚度和海绵状层呈现二次增长（P<0.05），乳头数量线性下降（P<0.05）。随着微量元素添加量的提高，每平方毫米蛋壳乳头数量下降。通过扫描电镜获得的蛋壳超微结构测定值使得我们可以比较不同来源以及不同剂量的锰、铜、锌效果。提高蛋壳海绵层厚度很重要，因为蛋壳强度取决于海绵层厚度和该层中方解石晶体的组织状况。Solomon的研究表明，海绵层的柱结构状况是蛋壳刚性的主要决定因素之一，因此也是蛋壳强度、蛋壳抗碎性的决定因素。传统认为，蛋壳抗碎性几乎完全取决于无机成分特性。蛋壳强度与厚度直接相关，而海绵层占蛋壳总厚度的约三分之二。因此，海绵层厚度的变化将可能影响蛋壳的抗破碎性，添加锰、锌和铜的日粮可改善蛋壳质量，特别是添加蛋白盐形式的微量元素。
蛋壳特性取决于微结构和化学成分，蛋壳厚度变化会导致蛋壳性质发生变化。据认为，添加的锰、锌和铜作为碳酸酐酶等重要酶的促进剂，可影响蛋壳厚度，参与蛋壳形成。此外，这些有机微量元素在特定时间分泌并渗入输卵管，并进入蛋壳的特定亚结构部位。例如，蛋白聚糖硫酸盐是乳头的主要成分，骨桥蛋白存在蛋壳中，与海绵状层特定方解石结晶面有关；锰会影响蛋白多糖，使形成的蛋壳更厚、抗破裂性能更强。
本研究发现未添加微量元素或添加最低水平微量元素的处理组中，蛋壳内表面乳头分布是杂乱的，乳头密度较高的蛋壳会出现这种现象，从而导致蛋壳强度较差。Van Toledo等的研究观察到具有高密度乳头、裂纹和刮痕的蛋壳其内表面较为杂乱，抗破碎性能较低。这些证据表明，不仅蛋壳厚度和质量比会影响抗破碎性能，蛋壳中的海绵层厚度和乳头数量也会影响蛋壳的抗破碎性能。
根据本研究，还能够推断，添加微量元素对海绵层的形成有影响，可在内表面形成更大的乳头，并改善蛋壳超微结构。
总之，蛋鸡日粮中添加锰、锌和铜不会影响关键的生产性能指标，如产蛋量、采食量和饲料转化率，但确实可改善蛋壳质量和超微结构。添加剂量65、60和10 mg/kg或以上的锰、锌和铜可降低鸡蛋损耗，提高蛋壳强度。
蛋鸡日粮的矿物质大多数是无机来源，如氧化物、硫酸盐、碳酸盐和磷酸盐，有机矿物元素也已进入市场，它们更容易为家禽吸收和保持，减少微量元素排放，从而减少潜在的环境污染。
AAFCO在2001提出了有机矿物质的概念，金属离子与有机化合物分子通过化学键连接，形成独特的结构，不但稳定性较好，同时也具有较高的生物利用率。但由于微量元素来源和添加水平不同，导致家禽日粮中添加有机微量元素的实际效果仍存在争议。
微量元素是蛋鸡日粮中必需的营养素，它们参与包括骨骼和蛋壳生成在内的正常生长发育过程。锌是碳酸酐酶抑制剂的一种辅助因子，参与蛋壳形成；锰是参与糖胺聚糖和糖蛋白合成的酶激活剂，有助于蛋壳有机基质的形成；铜是赖氨酰氧化酶的组成部分，对蛋壳膜中胶原蛋白的生成很重要。
蛋壳包括有机成分和无机成分。有机成分由壳膜、乳锥、蛋壳基质以及液膜组成。无机成分由碳酸钙晶体组成，从里到外的蛋壳层包括乳头层（内）、海绵层（中）和表面晶体层。蛋壳结构在一定程度上是因晶体生长期间相邻晶核对空间竞争所致。微量元素是蛋壳合成中的酶成分，并在蛋壳形成期间直接与钙晶体相互作用，从而影响蛋壳质量。不过，据文献报道，添加有机矿物质仍然存在争议。部分研究人员发现，有机和无机来源的锌、锰和铜对鸡蛋质量的影响没有差异。
微量元素锌、锰和铜会影响蛋壳的有机基质，从而影响到蛋壳的机械性能。构成有机基质的壳膜可在蛋壳内形成纤维强化网，有助于防止鸡蛋破碎。与蛋壳抗破碎有关的问题非常复杂，可能与有机和无机成分之间的相互作用有关。因此，对蛋壳进行超微结构评估可更深入了解蛋壳组织。
本研究的目标是评估日粮添加无机和有机微量元素对47～62周龄产蛋母鸡生产性能、蛋壳质量以及蛋壳超微结构的影响。
1 材料与方法
1.1 蛋鸡
试验在巴西巴拉那马林加州立大学试验农场进行。360羽47～62周龄的海兰W36蛋鸡饲养在集蛋笼（1 m×0.5 m）中，每重复为一笼8羽母鸡。蛋鸡自由采食和饮水，在开始试验前按照体重和产蛋量进行标准化（即将饲养蛋鸡按体重调整在平均体重的5 %SD范围）。只选择产蛋的母鸡，并进行14 d的适应。每天光照17 h，逐日记录舍内最低和最高平均温度，分别为17.4 ℃和26.5 ℃，相对湿度平均为37.6 %（最低）和84.6 %（最高）。
1.2 试验日粮
试验采用完全随机化设计，9个处理、5个重复，每个重复8羽蛋鸡。无机微量元素来源为硫酸锰（31 %）和硫酸锌（94 %）、氧化铜（24 %）。有机微量元素来源为锌蛋白盐（150 000 mg/kg）、锰蛋白盐（150 000 mg/kg）和铜蛋白盐（100 000 mg/kg）。处理分组见表1，对照日粮不添加锰、锌和铜。试验日粮根据产蛋阶段的现有行业标准配制。饲料组分比例和试验日粮计算值见表2。基础日粮在垂直混合机中混合，然后与不同来源的适量矿物质混合，获得试验日粮。
2 生产性能和蛋壳质量
以28 d为一个间隔记录日采食量（g/羽/d）、饲料转化率（千克饲料/打鸡蛋和千克饲料/千克鸡蛋）、产蛋率（%）、蛋损率（%）。日产蛋量以产蛋率（%）乘以平均蛋重（g）再除以100计算，变量均以每个重复均值表示（n=8羽蛋鸡）。蛋损（%）包括破损、裂纹、有孔或薄壳蛋。
在每个28 d间隔结束时，连续3 d评估如下指标：平均蛋重、蛋白高度、蛋比重、蛋壳质量比和蛋壳厚度。对每个试验单元中所有完好的鸡蛋逐个称重（0.01 g），然后采用盐水漂浮法测定蛋比重。在测定蛋比重后，每个试验单元取3枚鸡蛋样品，测定蛋白高度，并计算哈氏单位。
洗涤蛋壳并在室温下干燥72 h，使用精密电子天平称重（0.001 g）。计算蛋壳质量比。在称量蛋壳后，使用数字式千分仪测定每个蛋壳中央部位3个点的蛋壳厚度。在每个间隔期第28天，每个重复取3枚鸡蛋，使用质构仪测定蛋壳抗压能力。
3 蛋壳超微结构
在试验的最后一天（62周龄），每个重复随机收集2枚鸡蛋。打破鸡蛋并洗涤蛋壳，分离并保存赤道部位样本。将样品浸入6 %的次氯酸钠、4.12 %氯化钠和0.15 %氢氧化钠溶液中，除去壳膜。然后按照Radwan等介绍的方法在水中洗涤蛋壳，室温干燥48 h。每个鸡蛋制备2个蛋壳样本（0.5 m2），使用岛津SS-550进行扫描电镜分析。其中一个样本用于分析蛋壳内表面，另外一个用于评估横截面。将样本粘到铝制支撑物上，以金进行金属化，然后在电子显微镜下进行分析。对于内表面分析，每个样本放大50倍，得到乳头数/mm2和3个扫描图像。
蛋壳横断面分析中测定海绵层厚度（μm），乳头层厚度、以及总厚度（海绵层 乳头层）。计算每层厚度相对于总厚度值的比例。
4 统计分析
采用SAS统计软件进行统计分析。使用回归法分析微量元素添加剂量和来源的影响。
5 结果与讨论
蛋鸡日粮中添加不同剂量的锰、锌和铜，其生产性能指标和蛋品质回归分析结果见表3。微量元素来源和添加水平之间没有互作（P>0.05）。产蛋周期与微量元素来源之间、与添加量之间也没有相互影响。添加微量元素锰、锌和铜对产蛋性能、采食量、饲料转化率、蛋比重以及哈氏单位没有影响。
蛋重与锰、铜和锌含量呈现二次效应（P<0.05），但与来源无关。蛋壳厚度也为二次效应，取决于微量元素的添加水平（P<0.05）。微量元素来源对蛋壳厚度具有明显影响，有机微量元素具有更大的蛋壳厚度。微量元素蛋白盐是通过蛋白质水解获得，水解产物中含有氨基酸混合物和长度不等的小肽。以这种方式形成稳定的螯合物可保护微量元素在消化过程中不发生化学反应，通过胃肠道到达吸收部位期间保持这些物质的溶解性。因此无机和有机形式的微量元素合并使用可能更具优势。 通过肽和氨基酸途径吸收并运输微量元素，可增加消化期间的稳定性，提高生物利用率提高。不过尽管有机微量元素吸收增加，但在本研究中未观察到对生产性能的影响，而是观察到可能对蛋壳形成具有直接影响。锰、锌和铜添加量增加使得蛋损率线性下降（P<0.01）、蛋壳强度线性增加（P<0.05），表明形成的蛋壳质量更佳。
无论是有机还是无机来源的微量元素均可提高蛋壳强度，这也可能与蛋损下降有关系。日粮微量元素含量增加应与蛋壳膜形成有关。铜可改善壳膜，锌和锰参与蛋壳有机和无机化学反应，从而具有更优质的蛋壳。Maciel等也观察到这种影响，他们发现，蛋鸡日粮添加50 mg/kg的有机锌、锰和铜，蛋损率下降。蛋损率下降、蛋壳抗破碎性能增强是商品化蛋鸡业中具有经济意义的理想特性。本研究与Ludeen的研究结果一致，他们观察到饲喂锌和锰蛋白盐的60周龄蛋鸡抗碎裂性改善。Paik也报道有机锌和锰可改善蛋壳强度，锌对形成蛋壳必需的碳酸酐酶合成具有影响。
62周龄蛋鸡饲喂2种来源微量元素日粮的蛋壳超微结构回归分析结果见表4。添加微量元素的来源和含量之间没有相互作用（P>0.05）。在商品化蛋鸡日粮中添加锰、锌和铜对蛋壳乳头层厚度没有影响（P>0.05）。
微量元素锰、锌和铜含量会增加使蛋壳厚度和海绵状层呈现二次增长（P<0.05），乳头数量线性下降（P<0.05）。随着微量元素添加量的提高，每平方毫米蛋壳乳头数量下降。通过扫描电镜获得的蛋壳超微结构测定值使得我们可以比较不同来源以及不同剂量的锰、铜、锌效果。提高蛋壳海绵层厚度很重要，因为蛋壳强度取决于海绵层厚度和该层中方解石晶体的组织状况。Solomon的研究表明，海绵层的柱结构状况是蛋壳刚性的主要决定因素之一，因此也是蛋壳强度、蛋壳抗碎性的决定因素。传统认为，蛋壳抗碎性几乎完全取决于无机成分特性。蛋壳强度与厚度直接相关，而海绵层占蛋壳总厚度的约三分之二。因此，海绵层厚度的变化将可能影响蛋壳的抗破碎性，添加锰、锌和铜的日粮可改善蛋壳质量，特别是添加蛋白盐形式的微量元素。
蛋壳特性取决于微结构和化学成分，蛋壳厚度变化会导致蛋壳性质发生变化。据认为，添加的锰、锌和铜作为碳酸酐酶等重要酶的促进剂，可影响蛋壳厚度，参与蛋壳形成。此外，这些有机微量元素在特定时间分泌并渗入输卵管，并进入蛋壳的特定亚结构部位。例如，蛋白聚糖硫酸盐是乳头的主要成分，骨桥蛋白存在蛋壳中，与海绵状层特定方解石结晶面有关；锰会影响蛋白多糖，使形成的蛋壳更厚、抗破裂性能更强。
本研究发现未添加微量元素或添加最低水平微量元素的处理组中，蛋壳内表面乳头分布是杂乱的，乳头密度较高的蛋壳会出现这种现象，从而导致蛋壳强度较差。Van Toledo等的研究观察到具有高密度乳头、裂纹和刮痕的蛋壳其内表面较为杂乱，抗破碎性能较低。这些证据表明，不仅蛋壳厚度和质量比会影响抗破碎性能，蛋壳中的海绵层厚度和乳头数量也会影响蛋壳的抗破碎性能。
根据本研究，还能够推断，添加微量元素对海绵层的形成有影响，可在内表面形成更大的乳头，并改善蛋壳超微结构。
总之，蛋鸡日粮中添加锰、锌和铜不会影响关键的生产性能指标，如产蛋量、采食量和饲料转化率，但确实可改善蛋壳质量和超微结构。添加剂量65、60和10 mg/kg或以上的锰、锌和铜可降低鸡蛋损耗，提高蛋壳强度。