【摘 要】
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目的:寻找具有更强抗肿瘤活性和(或)较低毒副作用的TNF α突变蛋白.方法:应用巨引物二轮PCR技术对rh-TNFα的第80 、9 0和92位氨基酸编码的密码子进行定点突变, 经过DNA序列
【机 构】
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第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,上海,200433;基础医学部微生物学教研室;第二军医大学基础医学部基础医学部微生物学教研室,上海,200433;第二军医大学基础医学部基础医学部微生
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目的:寻找具有更强抗肿瘤活性和(或)较低毒副作用的TNF α突变蛋白.方法:应用巨引物二轮PCR技术对rh-TNFα的第80 、9 0和92位氨基酸编码的密码子进行定点突变, 经过DNA序列测定证实DNA突变准确后,将突变基因的cDNA插入pBL载体,转化大肠杆菌DH5α,获得表达rh-TNFα-D3a的工程菌.[ HT5W 〗结果:经巨引物二轮PCR获得表达TNFα突变蛋白的基因突变,经序列测定结果与设计一致,重组蛋白表达量占细菌总蛋白18.0%,大部分为可溶性,占rh-TNFα-D3a 总量的60%以上.重组蛋白经纯化,纯度＞98%.rh-TNFα-D3a对L929细胞表现出较高的细胞毒性,比活性大于5×108 IU/mg.与野生型的rh-TNFα相比,rh-TNFα-D3a的毒性降低为野生型的1/10,同时其保留了TNFα的抗肿瘤活性.结论:rh-TN F-αD3a是一个毒性较低,具有较强抗肿瘤作用的衍生物.
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