论文部分内容阅读
摘要
在前人研究的基础上， 结合国内外研究进展，使用HPLC的色素分析技术，从萃取剂的选择、样品干燥与否、静置时间以及超声方式等方面逐步优化沉积物中光合色素的萃取方法，完善海洋沉积物中18种光合色素的前处理技术。
关键词 光合色素；沉积物；萃取；高效液相
中图分类号 S931.3 文献标识码
A 文章编號 0517-6611（2014）31-10864-03
Research of Extraction Methods for Pothosynthetic Pigments in Sediments
TENG Deqiang1， CUI Zhenang1， YANG Nan1 et al （Guangzhou Marine Geological Survey， Guangzhou， Guangdong 510760）
Abstract Combined with the research progress both at home and abroad on the basis of previous studies， using HPLC pigment analysis technology， the sediments of the photosynthetic pigment extraction method， was optimized from the selection of extraction agent， dry samples or not， incubation time and ultrasonic method， etc. The marine sediments of 18 kinds of photosynthetic pigment preparation technology was improved.
Key words Pothosynthetic pigments； Sediments； Extraction； HPLC
海洋沉积物中光合色素（藻类色素、其他植物色素、细菌色素）能表征特定生物的种类和来源，作为一种重要的化学生物标志物，即使埋藏到沉积物甚至发生某些变化后仍保留其源信息[1]。在过去的几十年，随着科学技术的发展，海洋沉积色素在地球化学、海洋科学等领域起着越来越重要的作用[2-3]。
然而，在沉积色素分析的过程中，将色素从样品中定性、定量地提取到合适的溶剂中起着至关重要的作用。国内外有诸多学者对沉积色素的提取做过相关的研究。Zapata等[4]在探讨含吡啶组分的流动相分析方法时，采用的萃取剂是浓度95%甲醇。Fuco等[3-4]建议不采用冷冻干燥，应直接对样品进行萃取，认为冷冻干燥会使沉积物中的一部分色素降解[3-4]。Chen等[5]对沉积物提取色素时，为了萃取更加完整，加入萃取剂以后，在-20 ℃的冰箱中静置一夜（约12 h）。BuffanDubau等[6]也对沉积色素的提取方法进行了研究，但由于沉积物类型的多样性，并没有适合所有类型沉积物的统一的色素提取方法[7]。笔者在前人的基础上对18种沉积色素的提取方法进行了优化。
1 材料与方法
1.1 样品采集
根据《海洋调查规范》的表层沉积物均采用抓斗式采泥器采集，采样时间为2011年4月，地点为东海海域（E122°45′，N29°28′59.9″ ，2011年4月在长江口采集的样品，za5站位），取0～4 cm厚的表层沉积物，用锡纸小心包裹后用封口袋封装，并且保存于-20 ℃冰柜内。
1.2 HPLC参数设置
光合色素HPLC方法参考Zapata等[4]方法，选择二元梯度洗脱程序，2个流动相分别为A、B，流动相A为甲醇∶乙腈∶吡啶（50∶25∶25，体积比），流动相B为甲醇∶乙腈∶丙酮（20∶60∶20，体积比），流动相配制完成后经过全玻璃过滤系统的过滤，滤膜为0.2 μm的有机相过滤膜。其中，流动相A中吡啶溶液的配制方法如下：取900 ml MilliQ水至1 L烧杯中，加入10 ml醋酸和20 ml吡啶，并且用磁力搅拌器搅拌（转速1 500 r/m），之后逐滴加入醋酸，使pH达到5.0，再转移到1 L容量瓶中，并用MilliQ水定容至1 L。在流动相A配制完成后，一般选择在14 d内使用。
进样量为100 μl，柱温箱设置25 ℃，保持柱温恒定，二极管阵列检测器（DAD）检测波长为430、440和450 nm，设置带宽为8 nm。荧光检测器（FLD）的激发吸收波长分别为440和650 nm。梯度洗脱程序如表1所示，整个洗脱程序的运行需要47 min。在运行过程中系统流速始终是1 ml/min。
1.3 试验方案
选用长江口的一个表层沉积物为研究对象，把样品完全溶化后混匀，分成等份，每份2 g（下述试验中均使用此等份样品），冷藏备用。所有样品的萃取程序相同，取出每份2 g样品，加入萃取剂之后进行超声萃取，然后冷冻静置一段时间，离心后取上清液，再把提取物经0.45 μm PTFE滤膜（聚四氟乙烯滤膜）针筒滤器过滤，上机测定（每个条件下均有3个平行样）。所有操作均在弱光环境中进行，以避免色素降解。
1.3.1 萃取剂的选择。取出冷藏样品，分别用3 ml浓度80%、90%、95%以及100%的丙酮和浓度80%、90%、95%以及100%的甲醇萃取。除了选取的萃取剂不同，其余萃取程序过程相同，萃取过滤后上机测定。
在前人研究的基础上， 结合国内外研究进展，使用HPLC的色素分析技术，从萃取剂的选择、样品干燥与否、静置时间以及超声方式等方面逐步优化沉积物中光合色素的萃取方法，完善海洋沉积物中18种光合色素的前处理技术。
关键词 光合色素；沉积物；萃取；高效液相
中图分类号 S931.3 文献标识码
A 文章编號 0517-6611（2014）31-10864-03
Research of Extraction Methods for Pothosynthetic Pigments in Sediments
TENG Deqiang1， CUI Zhenang1， YANG Nan1 et al （Guangzhou Marine Geological Survey， Guangzhou， Guangdong 510760）
Abstract Combined with the research progress both at home and abroad on the basis of previous studies， using HPLC pigment analysis technology， the sediments of the photosynthetic pigment extraction method， was optimized from the selection of extraction agent， dry samples or not， incubation time and ultrasonic method， etc. The marine sediments of 18 kinds of photosynthetic pigment preparation technology was improved.
Key words Pothosynthetic pigments； Sediments； Extraction； HPLC
海洋沉积物中光合色素（藻类色素、其他植物色素、细菌色素）能表征特定生物的种类和来源，作为一种重要的化学生物标志物，即使埋藏到沉积物甚至发生某些变化后仍保留其源信息[1]。在过去的几十年，随着科学技术的发展，海洋沉积色素在地球化学、海洋科学等领域起着越来越重要的作用[2-3]。
然而，在沉积色素分析的过程中，将色素从样品中定性、定量地提取到合适的溶剂中起着至关重要的作用。国内外有诸多学者对沉积色素的提取做过相关的研究。Zapata等[4]在探讨含吡啶组分的流动相分析方法时，采用的萃取剂是浓度95%甲醇。Fuco等[3-4]建议不采用冷冻干燥，应直接对样品进行萃取，认为冷冻干燥会使沉积物中的一部分色素降解[3-4]。Chen等[5]对沉积物提取色素时，为了萃取更加完整，加入萃取剂以后，在-20 ℃的冰箱中静置一夜（约12 h）。BuffanDubau等[6]也对沉积色素的提取方法进行了研究，但由于沉积物类型的多样性，并没有适合所有类型沉积物的统一的色素提取方法[7]。笔者在前人的基础上对18种沉积色素的提取方法进行了优化。
1 材料与方法
1.1 样品采集
根据《海洋调查规范》的表层沉积物均采用抓斗式采泥器采集，采样时间为2011年4月，地点为东海海域（E122°45′，N29°28′59.9″ ，2011年4月在长江口采集的样品，za5站位），取0～4 cm厚的表层沉积物，用锡纸小心包裹后用封口袋封装，并且保存于-20 ℃冰柜内。
1.2 HPLC参数设置
光合色素HPLC方法参考Zapata等[4]方法，选择二元梯度洗脱程序，2个流动相分别为A、B，流动相A为甲醇∶乙腈∶吡啶（50∶25∶25，体积比），流动相B为甲醇∶乙腈∶丙酮（20∶60∶20，体积比），流动相配制完成后经过全玻璃过滤系统的过滤，滤膜为0.2 μm的有机相过滤膜。其中，流动相A中吡啶溶液的配制方法如下：取900 ml MilliQ水至1 L烧杯中，加入10 ml醋酸和20 ml吡啶，并且用磁力搅拌器搅拌（转速1 500 r/m），之后逐滴加入醋酸，使pH达到5.0，再转移到1 L容量瓶中，并用MilliQ水定容至1 L。在流动相A配制完成后，一般选择在14 d内使用。
进样量为100 μl，柱温箱设置25 ℃，保持柱温恒定，二极管阵列检测器（DAD）检测波长为430、440和450 nm，设置带宽为8 nm。荧光检测器（FLD）的激发吸收波长分别为440和650 nm。梯度洗脱程序如表1所示，整个洗脱程序的运行需要47 min。在运行过程中系统流速始终是1 ml/min。
1.3 试验方案
选用长江口的一个表层沉积物为研究对象，把样品完全溶化后混匀，分成等份，每份2 g（下述试验中均使用此等份样品），冷藏备用。所有样品的萃取程序相同，取出每份2 g样品，加入萃取剂之后进行超声萃取，然后冷冻静置一段时间，离心后取上清液，再把提取物经0.45 μm PTFE滤膜（聚四氟乙烯滤膜）针筒滤器过滤，上机测定（每个条件下均有3个平行样）。所有操作均在弱光环境中进行，以避免色素降解。
1.3.1 萃取剂的选择。取出冷藏样品，分别用3 ml浓度80%、90%、95%以及100%的丙酮和浓度80%、90%、95%以及100%的甲醇萃取。除了选取的萃取剂不同，其余萃取程序过程相同，萃取过滤后上机测定。