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摘 要：目的：建立柴连口服液中柴胡总皂苷（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）的含量测定方法。方法：高效液相色谱法，采用Spuril C18（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-水（77：23）（用三乙胺调节pH至7.5）；柱温：35℃；进样量：20μL；检测波长：220nm；流速：1.0mL·min-1。结果：柴胡皂苷a在4.128μg·ml-1～82.56μg·ml-1浓度范围内线性关系良好，R=0.9994；。柴胡皂苷d在5.644μg·ml-1～112.88μg·ml-1浓度范围内线性关系良好，R=0.9998；平均回收率为98.70%，RSD=0.77%。结论：本方法准确性、重复性好、回收率高，适用于柴连口服液的质量控制。
关键词：柴连口服液；柴胡总皂苷（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）；高效液相色谱法
柴连口服液由麻黄、柴胡、广藿香、肉桂、连翘、桔梗六味中药经水蒸气蒸馏，煎液浓缩等一系列工艺加工制成的中药口服液。主要用于解表宣肺，化湿和中，适用于感冒风寒、风寒挟湿证者，证见恶寒、发热、头痛、鼻塞、咳嗽、咽干、恶心等。柴连口服液中除了挥发油成分，其抗炎的主要有效成分为皂苷类，柴胡中含有大量柴胡皂苷成分，主要是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量高。依据2015年版中国药典一部，建立了产品中柴胡总皂苷的含量测定方法，并对该方法进行了验证试验。
1 对照品、样品及试药
柴胡皂苷a对照品（中检所，批號：110777-200507，含量：100%）；柴胡皂苷d对照品（中检所，批号：110778-200506，含量：100%）；柴连口服液（市售样品，规格：10ml/支）；甲醇、磷酸为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2仪器、色谱条件与系统适用性
Waters高效液相色谱仪；Spuril C18（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-水（77：23）（用三乙胺调节pH至7.5）；柱温：35℃；进样量：20μL；检测波长：220nm；流速：1.0mL·min-1。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于8000。
3 对照品溶液、供试品溶液的制备
3.1 对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1ml含柴胡皂苷a40μg、柴胡皂苷d 55μg的溶液，摇匀，即得。
3.2 供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4 专属性试验
按工艺制备不含柴胡的空白样品，精密量取空白样品溶液2ml，按供试品溶液处理方法，照上述色谱条件，将对照品溶液、空白样品供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果在与柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品相应的保留时间处无色谱峰，表明处方中其他成分及辅料对测定无干扰。本方法专属性良好。
5 线性关系考察
分别精密称取柴胡皂苷a对照品20.64mg、柴胡皂苷d对照品28.22mg，分别置50ml量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2，0ml，分别置10ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到系列浓度的对照品溶液，照上述色谱条件与系统适用性，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，分别对柴胡皂苷a、柴胡皂苷d进行线性回归，具体计算结果如表1。
结果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在各自浓度范围内具有良好的线性关系。
6 精密度试验
分别取线性关系考察项下浓度为41.28μg·mL-1柴胡皂苷a对照品溶液，浓度为56.44μg·mL-1柴胡皂苷d对照品溶液，照上述色谱条件，精密吸取20μL，分别连续进样6次，考察各自峰面积，RSD分别为0.9%、0.75%，均小于2.0%，仪器精密度良好。
7 重复性试验
取同一批样品，精密量取本品2ml，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，即得重复性试验供试品溶液。平行处理6份样品，照上述色谱条件，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，计算出各自含量，结果表2。
结果表明，重复性试验含量结果的RSD（%）均小于2.0%，本方法重复性良好。
8 回收率试验
采用加样回收的方法。回收率试验对照品混合储备液的配制：精密称取柴胡皂苷a对照品29.49mg和柴胡皂苷d对照品30.52mg，置25ml量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。回收率样品溶液制备：精密量取本品1ml，量取9份，分别精密加入对照品混合储备液0.8ml、1.0ml、1.2ml（相当于已知含量样品1ml的80%、100%、120%的含量），各3份，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件，进样20μL，记录色谱图，计算回收率，具体数据见表3。
结果表明，各浓度下的柴胡总皂苷平均回收率均在98%～102%之间，9个回收率数据的RSD（%）小于2.0%，该方法回收率良好、准确度高。
9 溶液稳定性考察
取本品供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时，将供试品溶液注入液相色谱仪，分别记录不同时间点柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面积。结果峰面积的RSD分别为0.93%、1.03%，RSD均小于2.0%，表明12小时内样品供试品溶液稳定，可以用于含量测定。
10 讨论
10.1 柴连口服液中含有六味中药，有效成分复杂，所以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量测定干扰较多，参照药典，最后将检测波长定在220nm，因为本品在210nm有其他成分物质紫外吸收干扰。
10.2 药典标准中柴胡药材的柴胡皂苷a、d流动相采用乙腈-水不同比例梯度洗脱，保留时间较长，不适用于组方复杂的本品口服液。由于柴胡皂苷显酸性，所以流动相系统加入三乙胺调节pH值，使流动相系统呈弱碱性，利于皂苷在色谱柱中解离，缩短保留时间，改善色谱峰拖尾现象，优化了色谱峰形。
参考文献
[1]鲁湘鄂，郭海福，汪洪武，李湘.HPLC法测定柴胡中柴胡皂苷a，d的含量.肇庆学院学报，2006，27（2）：43-46.
[2]中华人民共和国药典（一部）.化学工业出版社，2015：280-281.
关键词：柴连口服液；柴胡总皂苷（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）；高效液相色谱法
柴连口服液由麻黄、柴胡、广藿香、肉桂、连翘、桔梗六味中药经水蒸气蒸馏，煎液浓缩等一系列工艺加工制成的中药口服液。主要用于解表宣肺，化湿和中，适用于感冒风寒、风寒挟湿证者，证见恶寒、发热、头痛、鼻塞、咳嗽、咽干、恶心等。柴连口服液中除了挥发油成分，其抗炎的主要有效成分为皂苷类，柴胡中含有大量柴胡皂苷成分，主要是柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量高。依据2015年版中国药典一部，建立了产品中柴胡总皂苷的含量测定方法，并对该方法进行了验证试验。
1 对照品、样品及试药
柴胡皂苷a对照品（中检所，批號：110777-200507，含量：100%）；柴胡皂苷d对照品（中检所，批号：110778-200506，含量：100%）；柴连口服液（市售样品，规格：10ml/支）；甲醇、磷酸为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2仪器、色谱条件与系统适用性
Waters高效液相色谱仪；Spuril C18（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-水（77：23）（用三乙胺调节pH至7.5）；柱温：35℃；进样量：20μL；检测波长：220nm；流速：1.0mL·min-1。理论板数按柴胡皂苷a峰计算应不低于8000。
3 对照品溶液、供试品溶液的制备
3.1 对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1ml含柴胡皂苷a40μg、柴胡皂苷d 55μg的溶液，摇匀，即得。
3.2 供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4 专属性试验
按工艺制备不含柴胡的空白样品，精密量取空白样品溶液2ml，按供试品溶液处理方法，照上述色谱条件，将对照品溶液、空白样品供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果在与柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品相应的保留时间处无色谱峰，表明处方中其他成分及辅料对测定无干扰。本方法专属性良好。
5 线性关系考察
分别精密称取柴胡皂苷a对照品20.64mg、柴胡皂苷d对照品28.22mg，分别置50ml量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2，0ml，分别置10ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到系列浓度的对照品溶液，照上述色谱条件与系统适用性，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，分别对柴胡皂苷a、柴胡皂苷d进行线性回归，具体计算结果如表1。
结果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在各自浓度范围内具有良好的线性关系。
6 精密度试验
分别取线性关系考察项下浓度为41.28μg·mL-1柴胡皂苷a对照品溶液，浓度为56.44μg·mL-1柴胡皂苷d对照品溶液，照上述色谱条件，精密吸取20μL，分别连续进样6次，考察各自峰面积，RSD分别为0.9%、0.75%，均小于2.0%，仪器精密度良好。
7 重复性试验
取同一批样品，精密量取本品2ml，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，即得重复性试验供试品溶液。平行处理6份样品，照上述色谱条件，分别精密吸取20μL，注入液相色谱仪，计算出各自含量，结果表2。
结果表明，重复性试验含量结果的RSD（%）均小于2.0%，本方法重复性良好。
8 回收率试验
采用加样回收的方法。回收率试验对照品混合储备液的配制：精密称取柴胡皂苷a对照品29.49mg和柴胡皂苷d对照品30.52mg，置25ml量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。回收率样品溶液制备：精密量取本品1ml，量取9份，分别精密加入对照品混合储备液0.8ml、1.0ml、1.2ml（相当于已知含量样品1ml的80%、100%、120%的含量），各3份，置中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径2.0cm）上，用80%甲醇40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加10%浓氨试液3滴，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述色谱条件，进样20μL，记录色谱图，计算回收率，具体数据见表3。
结果表明，各浓度下的柴胡总皂苷平均回收率均在98%～102%之间，9个回收率数据的RSD（%）小于2.0%，该方法回收率良好、准确度高。
9 溶液稳定性考察
取本品供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时，将供试品溶液注入液相色谱仪，分别记录不同时间点柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面积。结果峰面积的RSD分别为0.93%、1.03%，RSD均小于2.0%，表明12小时内样品供试品溶液稳定，可以用于含量测定。
10 讨论
10.1 柴连口服液中含有六味中药，有效成分复杂，所以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量测定干扰较多，参照药典，最后将检测波长定在220nm，因为本品在210nm有其他成分物质紫外吸收干扰。
10.2 药典标准中柴胡药材的柴胡皂苷a、d流动相采用乙腈-水不同比例梯度洗脱，保留时间较长，不适用于组方复杂的本品口服液。由于柴胡皂苷显酸性，所以流动相系统加入三乙胺调节pH值，使流动相系统呈弱碱性，利于皂苷在色谱柱中解离，缩短保留时间，改善色谱峰拖尾现象，优化了色谱峰形。
参考文献
[1]鲁湘鄂，郭海福，汪洪武，李湘.HPLC法测定柴胡中柴胡皂苷a，d的含量.肇庆学院学报，2006，27（2）：43-46.
[2]中华人民共和国药典（一部）.化学工业出版社，2015：280-281.