【摘 要】
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目的:重组表达醛脱氢酶8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family member A1,ALDH8A1)蛋白,制备其多克隆抗体,并进行抗体的特异性鉴定,以及蛋白在组织和细胞内的定位.方法:以成人
【机 构】
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蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射与辐射医学研究所,北京,102206燕山大学研究生院,河北,秦皇岛,066004;哈尔滨医科大学药学院,黑龙江,哈尔滨,150081;蛋白质组学
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目的:重组表达醛脱氢酶8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family member A1,ALDH8A1)蛋白,制备其多克隆抗体,并进行抗体的特异性鉴定,以及蛋白在组织和细胞内的定位.方法:以成人肝cDNA文库为模板,PCR扩增ALDH8A1目的片段,并构建重组表达载体pGEX- 4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1,经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后,转化大肠杆菌BL21,诱导表达GST-ALDH8A1和 His-ALDH8A1融合蛋白.经Western blot确定其为目的蛋白后,纯化重组融合蛋白,并以GST-ALDH8A1免疫家兔制备抗人ALDH8A1多克隆抗体.用His-ALDH8A1包板,ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价;Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性;免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位.结果:成功构建重组表达载体pGEX- 4T-1-ALDH8A1和pET-32a-ALDH8A1;获得包涵体形式表达的GST-ALDH8A1和可溶性形式表达的 His-ALDH8A1融合蛋白;应用纯化的重组蛋白GST-ALDH8A1免疫家兔,获得兔抗人ALDH8A1血清,ELISA测定抗血清的效价为1∶ 256 000.Western blot结果显示,制备的ALDH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量(Mr)约53 000的ALDH8A1天然蛋白,与文献报道的ALDH8A1的Mr一致,表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达.免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中.结论:成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体,此抗体可应用于ELISA,Western blot和免疫组化检测,为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础.
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