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[摘要]目的：探讨血液中外泌体miRNA-301在胃癌患者血清中的表达及临床意义。方法：选择我院行胃癌手术及随访资料完整的胃癌患者（70例）和健康对照者（70例）为研究对象，抽取未行任何治疗的静脉血，提取血清外泌体，以及外泌体总RNA，并检测胃癌和健康对照者外泌体中的miR-301表达水平。分析胃癌和健康对照者血清外泌体中miR-301表达差异及血清外泌体中miR-301表达水平与胃癌临床病理参数的关系。结果：胃癌患者血清外泌体中miR-301的表达水平为（7.17±0.98）fmol/L，显著高于健康对照者[（0.93±0.61）fmol/L，P<0.01]，同时外泌体miR-301的受试者工作特征曲线显示，血清外泌体miR-301对胃癌诊断具有良好的特异度和敏感度（曲线下面积0.948）;进一步分析发现：外泌体miR-301与胃癌患者的性别、年龄、分化程度等无相关性（P>0.05），而与患者肿瘤大小、TNM分期及Hp感染状态明显相关（P<0.05）。结论：血清外泌体miR-301的检测可能有助于胃癌的诊断。
[关键词]MicroRNA，胃癌，敏感度，特异性，肿瘤标志物
[中图分类号]R735.2[文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）22-0018-02
胃癌是全球范围内发病率最高的肿瘤之一，而我国是胃癌的高发区，年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。近30%患者在初诊时已是晚期，40%局灶肿瘤患者在术后出现复发与转移，10%-20%晚期胃癌患者对化疗药物如顺铂耐药，且其他患者在化疗6-15个月逐渐产生耐药，从而导致肿瘤进展，预后极差。为了提高胃癌患者的生存质量，改善胃癌患者的预后，我们应寻找胃癌早期诊断的途径。目前的研究热点为无创检测的血清学标志物，这些血清学标志物可作为胃癌的生物学标志物。CA-199、CEA等肿瘤标志物是目前临床较常应用于诊断胃癌的血清学标志物，但其敏感度和特异性较低，所以需要寻找一种或几种敏感度和特异性较高的胃癌血清标志物提高胃癌的早期诊断以及改善胃癌患者的预后情况。
1材料与方法
1.1入组患者信息 我们收集了70例2016年1月-2018年12月在我院住院的胃癌患者的血清标本，这些患者均行术后病理并经病理证实为胃癌。这些患者均未接受任何肿瘤相关的治疗。70例患者中，男性为41例，女性为29例;患者年龄37～82岁，平均年龄为（59.11±14.77）岁;按2010年国际抗癌联盟（UICC）TNM标准分期，这70例胃癌患者可分为：I/Ⅱ期：43例，Ⅲ/Ⅳ期：27例;高、中分化肿瘤：47例，低分化肿瘤：23例。幽门螺杆菌阳性41例，阴性29例。70例健康对照组的血清标本均来源于本院的健康体检者。该临床试验已通过南通大学附属医院伦理委员会的批准，所有血清标本均获知情同意书。
1.2研究方法（1）收集标本：将患者5mL静脉外周血收集于采血管中并标记患者基本信息，24h内离心，收集上层血清，并储存至-80℃冰箱保存。提取外泌体时，解冻血清，并通过3000r/min，15min离心处理，去除沉淀和脂质层，再在13000r/min，2min离心去除红细胞等残留的细胞物质，留取沉淀，即外泌体。（2）外泌体中的miRNA的提取：按QIAZOL试剂盒步骤进行外泌体miRNA的提取。（3）miRNA的逆转录及定量检测：参照美国TaqMan逆转录试剂盒行逆转录，逆轉录反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃10min。（4）荧光定量PCR检测外泌体miRNA表达量：PCR反应体系为nuclease-free water 8pL，2x miR-A PCR Mix IOpL，cDNA模板为2uL。根据PCR上机数据获得GAPDH的CT值作为质控参数，PCR的反应条件为95℃预变性5分钟;95℃变性15S，60℃退火60S，一共为40个循环。以U6作为内参，采用2-△△CT法计算外泌体中miR-301的表达量，结果以倍数来表示。
1.3统计方法分析所得数据采用SPSS25.0软件。比较外泌体miR-301在胃癌和健康对照者血清中的差异表达时使用配对样本的t检验分析，比较血清外泌体miR-301表达水平与胃癌的临床病理参数间关系时用两独立样本的t检验或单因素方差分析的方法，血清外泌体miRNA-301作为胃癌诊断分子标记的敏感度和特异度用ROC曲线的曲线下面积计算，当P<0.05时表明差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1外泌体miR-301表达水平在胃癌和健康对照组血清中的比较通过RT-PCR检测70例胃癌患者和健康对照组血清外泌体miR-301的表达水平差异。研究结果表明，健康对照组中外泌体miR-301表达水平为（0.91±1.09）fmol/L，而胃癌组外泌体miR-301表达水平为（6.71±1.08）fmol/L，差别具有统计学意义（P<0.01）
2.2血清外泌体miR-301表达水平与胃癌临床病理参数的关系通过RT-PCR分析，我们发现，有淋巴结转移或者病理分化程度较低的患者，血清外泌体的miR-301的表达水平较对照组稍高，但差异无统计学意义（P>0.05）。外泌体中miR-301的表达水平与胃癌患者的性别、年龄、分化程度等无相关性（P>0.05），而外泌体中miR-301的表达水平与患者肿瘤大小、TNM分期及幽门螺杆菌感染状态呈明显相关性且差别具有统计学意义（P<0.05，表1）。
2.3血清外泌体中CEA、CA-199、miR-30l诊断胃癌可靠性的分析通过SPSS分析ROC曲线提示：血清中CEA、CA-199、miR-301诊断胃癌的曲线下面积（AUC）结果分别为CEA 0.712、CA1990.614、miR-3010.948。诊断胃癌的最佳外泌体miR-301浓度截断值为0.58fmol/L，其灵敏度和特异性分别为95%、97.5%（图1，表2）。
4讨论
外泌体是指包含了miRNA、lncRNA、circRNA、脂质和蛋白质的双层膜性小囊泡（直径在30～150nm之间），外泌体可保护其中的RNA免受酶的降解。外泌体可参与细胞活动，如肿瘤转移、免疫调控、疾病发生发展等，故外泌体有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
近几年研究发现，miRNA可在外周血的外泌体中稳定存在，且最新研究结果表明外周绝大多数miRNA来源于外泌体，外泌体可保护循环miRNA，使其免受RNA酶降解，故目前将外周血中外泌体源性miRNAs作为一种新型胃癌标志物。研究表明胃癌患者血清外泌体中miR-451、miR-221和miR-1较对照组呈高表达，且miR-221的表达与胃癌TNM分期相关，外泌体中miR-221的表达越高，肿瘤恶性程度越高。而前期研究表明，在胃癌组织中miR-301表达较对照组明显增高，故本研究选择miR-301作为外泌体标志物进行早期诊断胃癌。我们此次研究结果表明，胃癌患者血清外泌体miRNA-301的表达较健康对照组明显升高，其表达升高的程度与胃癌的分期、肿瘤大小和幽门螺杆菌感染密切相关。ROC曲线分析指出，诊断胃癌的最佳外泌体miR-301浓度截断值为0.56fmol/L，其灵敏度和特异度分别为95%与92.5%，曲线下面积0.948，提示对于胃癌而言，血清外泌体miR-301具有良好的诊断价值。
血清外泌体miRNA-301与胃癌的分期、转移密切相关，有望成为胃癌治疗的新靶点，尤其是外泌体可作为内源性纳米级生物膜结构，顺利通过血脑屏障并避免毒性和机体的免疫排斥，同时也能较好保证内容物完整性以及生物活性。这些优势有效提升了外泌体miRNA应用于肿瘤生物靶向治疗的可行性。另外，外泌体miRNA可通过液体活检检测出，具有敏感性高，创伤小等优势。但目前外泌体miRNAs与胃癌研究仍处于初级阶段，很多功能尚未被发现，如外泌体miRNA对免疫系统的作用等，随着进一步的研究深入，外周血外泌体miR-301的检测有望成为诊断胃癌及评价预后的重要指标。
[关键词]MicroRNA，胃癌，敏感度，特异性，肿瘤标志物
[中图分类号]R735.2[文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）22-0018-02
胃癌是全球范围内发病率最高的肿瘤之一，而我国是胃癌的高发区，年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。近30%患者在初诊时已是晚期，40%局灶肿瘤患者在术后出现复发与转移，10%-20%晚期胃癌患者对化疗药物如顺铂耐药，且其他患者在化疗6-15个月逐渐产生耐药，从而导致肿瘤进展，预后极差。为了提高胃癌患者的生存质量，改善胃癌患者的预后，我们应寻找胃癌早期诊断的途径。目前的研究热点为无创检测的血清学标志物，这些血清学标志物可作为胃癌的生物学标志物。CA-199、CEA等肿瘤标志物是目前临床较常应用于诊断胃癌的血清学标志物，但其敏感度和特异性较低，所以需要寻找一种或几种敏感度和特异性较高的胃癌血清标志物提高胃癌的早期诊断以及改善胃癌患者的预后情况。
1材料与方法
1.1入组患者信息 我们收集了70例2016年1月-2018年12月在我院住院的胃癌患者的血清标本，这些患者均行术后病理并经病理证实为胃癌。这些患者均未接受任何肿瘤相关的治疗。70例患者中，男性为41例，女性为29例;患者年龄37～82岁，平均年龄为（59.11±14.77）岁;按2010年国际抗癌联盟（UICC）TNM标准分期，这70例胃癌患者可分为：I/Ⅱ期：43例，Ⅲ/Ⅳ期：27例;高、中分化肿瘤：47例，低分化肿瘤：23例。幽门螺杆菌阳性41例，阴性29例。70例健康对照组的血清标本均来源于本院的健康体检者。该临床试验已通过南通大学附属医院伦理委员会的批准，所有血清标本均获知情同意书。
1.2研究方法（1）收集标本：将患者5mL静脉外周血收集于采血管中并标记患者基本信息，24h内离心，收集上层血清，并储存至-80℃冰箱保存。提取外泌体时，解冻血清，并通过3000r/min，15min离心处理，去除沉淀和脂质层，再在13000r/min，2min离心去除红细胞等残留的细胞物质，留取沉淀，即外泌体。（2）外泌体中的miRNA的提取：按QIAZOL试剂盒步骤进行外泌体miRNA的提取。（3）miRNA的逆转录及定量检测：参照美国TaqMan逆转录试剂盒行逆转录，逆轉录反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃10min。（4）荧光定量PCR检测外泌体miRNA表达量：PCR反应体系为nuclease-free water 8pL，2x miR-A PCR Mix IOpL，cDNA模板为2uL。根据PCR上机数据获得GAPDH的CT值作为质控参数，PCR的反应条件为95℃预变性5分钟;95℃变性15S，60℃退火60S，一共为40个循环。以U6作为内参，采用2-△△CT法计算外泌体中miR-301的表达量，结果以倍数来表示。
1.3统计方法分析所得数据采用SPSS25.0软件。比较外泌体miR-301在胃癌和健康对照者血清中的差异表达时使用配对样本的t检验分析，比较血清外泌体miR-301表达水平与胃癌的临床病理参数间关系时用两独立样本的t检验或单因素方差分析的方法，血清外泌体miRNA-301作为胃癌诊断分子标记的敏感度和特异度用ROC曲线的曲线下面积计算，当P<0.05时表明差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1外泌体miR-301表达水平在胃癌和健康对照组血清中的比较通过RT-PCR检测70例胃癌患者和健康对照组血清外泌体miR-301的表达水平差异。研究结果表明，健康对照组中外泌体miR-301表达水平为（0.91±1.09）fmol/L，而胃癌组外泌体miR-301表达水平为（6.71±1.08）fmol/L，差别具有统计学意义（P<0.01）
2.2血清外泌体miR-301表达水平与胃癌临床病理参数的关系通过RT-PCR分析，我们发现，有淋巴结转移或者病理分化程度较低的患者，血清外泌体的miR-301的表达水平较对照组稍高，但差异无统计学意义（P>0.05）。外泌体中miR-301的表达水平与胃癌患者的性别、年龄、分化程度等无相关性（P>0.05），而外泌体中miR-301的表达水平与患者肿瘤大小、TNM分期及幽门螺杆菌感染状态呈明显相关性且差别具有统计学意义（P<0.05，表1）。
2.3血清外泌体中CEA、CA-199、miR-30l诊断胃癌可靠性的分析通过SPSS分析ROC曲线提示：血清中CEA、CA-199、miR-301诊断胃癌的曲线下面积（AUC）结果分别为CEA 0.712、CA1990.614、miR-3010.948。诊断胃癌的最佳外泌体miR-301浓度截断值为0.58fmol/L，其灵敏度和特异性分别为95%、97.5%（图1，表2）。
4讨论
外泌体是指包含了miRNA、lncRNA、circRNA、脂质和蛋白质的双层膜性小囊泡（直径在30～150nm之间），外泌体可保护其中的RNA免受酶的降解。外泌体可参与细胞活动，如肿瘤转移、免疫调控、疾病发生发展等，故外泌体有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
近几年研究发现，miRNA可在外周血的外泌体中稳定存在，且最新研究结果表明外周绝大多数miRNA来源于外泌体，外泌体可保护循环miRNA，使其免受RNA酶降解，故目前将外周血中外泌体源性miRNAs作为一种新型胃癌标志物。研究表明胃癌患者血清外泌体中miR-451、miR-221和miR-1较对照组呈高表达，且miR-221的表达与胃癌TNM分期相关，外泌体中miR-221的表达越高，肿瘤恶性程度越高。而前期研究表明，在胃癌组织中miR-301表达较对照组明显增高，故本研究选择miR-301作为外泌体标志物进行早期诊断胃癌。我们此次研究结果表明，胃癌患者血清外泌体miRNA-301的表达较健康对照组明显升高，其表达升高的程度与胃癌的分期、肿瘤大小和幽门螺杆菌感染密切相关。ROC曲线分析指出，诊断胃癌的最佳外泌体miR-301浓度截断值为0.56fmol/L，其灵敏度和特异度分别为95%与92.5%，曲线下面积0.948，提示对于胃癌而言，血清外泌体miR-301具有良好的诊断价值。
血清外泌体miRNA-301与胃癌的分期、转移密切相关，有望成为胃癌治疗的新靶点，尤其是外泌体可作为内源性纳米级生物膜结构，顺利通过血脑屏障并避免毒性和机体的免疫排斥，同时也能较好保证内容物完整性以及生物活性。这些优势有效提升了外泌体miRNA应用于肿瘤生物靶向治疗的可行性。另外，外泌体miRNA可通过液体活检检测出，具有敏感性高，创伤小等优势。但目前外泌体miRNAs与胃癌研究仍处于初级阶段，很多功能尚未被发现，如外泌体miRNA对免疫系统的作用等，随着进一步的研究深入，外周血外泌体miR-301的检测有望成为诊断胃癌及评价预后的重要指标。