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摘要：为了在转化当代获得纯合的转基因株系，本试验对以小麦花药为受体的转基因方法进行了系统研究。结果表明，金粉粒度0.6μm、金粉浓度100μg/枪、轰击距离6cm、轰击压力1300psi为基因枪转化小麦花药的最佳参数组合。用含有5%DMSO的0.2%秋水仙碱溶液处理单倍体植株4h，染色体加倍效率最高，达到100%；用含1%DMSO的溶液处理12h加倍效率最低，为62.2%。PCR结果显示所有T0代阳性植株在T1代都无分离，说明该方法得到的转基因株系在T0代即为纯合系。本研究成功建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系，为小麦遗传改良提供了一种新的方法。
关键词：小麦；转基因；受体；花药；染色体加倍
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0001-06
小麦是重要的粮食作物之一，小麦生产的可持续性对于保障粮食安全至关重要。然而，由于缺少高抗生物或非生物逆境的小麦种质资源，在有限的土地资源上进一步提高小麦产量异常艰难。转基因技术为利用异源基因改良小麦的抗逆性、实现种质资源创新的新突破提供了新的机遇[1]。
愈伤组织诱导和再生是小麦转基因的关键步骤，迄今为止，已成功用于小麦遗传转化的外植体有幼胚[2，3]、幼穗[4]、花药诱导后的胚状体[5，6]、小孢子[7]、成熟胚[8]等。这些外植体中，除了花药诱导后的胚状体和小孢子为单倍体外，其余皆是二倍体。由于小麦基因组庞大，含有42条染色体，转基因后代纯合过程较慢。而以单倍体为受体的转基因植株经过染色体加倍，可以在转化当代获得纯合株系，大大缩短出圃年限。影响染色体加倍效率的因素有很多，植株的发育状态、试剂的种类、处理时间等都会对加倍效率产生影响[9]。秋水仙碱是目前应用最为广泛的加倍剂，但处理不当会对植株产生致死性的伤害[10]。
到目前为止，未见有以小麦花药作为转基因受体的报道。以花药为受体的小麦转基因技术首先要获得转化的单倍体植株，然后经过染色体加倍得到可育的转基因后代。为了建立以小麦离体花药为受体的外源基因导入技术体系，探索高效的染色体加倍技术，本试验对影响小麦基因枪转化和单倍体加倍的因素进行了详细的研究，建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系。
1材料与方法
1.1质粒及试剂
本试验所用的质粒为pHAC25，由山东省农业科学院作物所分子生物学实验室保存。
质粒提取试剂盒购自天根生物；培养基配制所需的无机盐购自国药集团；维生素和抗生素以及激素、GUS染色所需的药品购自Sigma公司；金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自伯乐公司。
1.2花药的分离与预处理
花药供体品种为K35，是山东省农科院作物所自行选育的具有良好花药培养能力的高代小麦品系。显微镜下观察花药发育情况，选择单核靠边期的花药（图1A），放入盛有0.3mol/L甘露醇预处理液的培养皿中，每皿500粒，4℃放置约16h（图1B）。将浸泡完全的花药转移到诱导培养基上（培养皿下放有画有基因枪轰击圈的白纸），每皿500粒，用于基因枪转化。
1.3子弹制备与花药转化
取金粉10mg，70%乙醇冲洗，10000r/min离心1min，重复3次，加入1ml灭菌水振荡2min，制成终浓度为10μg/μl的金粉贮藏液。将金粉贮藏液充分涡旋，取100μl放入硅化的1.5ml离心管中，14000r/min离心30s，弃上清；加入50μl灭菌水悬浮金粉，在振荡器上边轻微振荡边加入1μg/μl的质粒10μl，再加入20μl新配制的0.1mol/L的亚精胺和50μl2.5mol/L的CaCl2，高速蜗旋3min，将离心管在冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清；加入无水乙醇750μl，高速蜗旋，冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清，用100μl无水乙醇悬浮。
将制备的子弹用基因枪轰击预处理后的花药。
1.4诱导培养与再生苗的筛选及染色体加倍
于无菌操作台中将轰击后的花药转移到花药愈伤诱导培养基上（图1C），32℃暗培养3d后，28℃暗培养约4周，获得胚状体（图1D）。将1～2mm左右的胚状体转移到含有5mg/Lbiolaphos的再生培养基上，25℃下进行再生筛选培养（每天光照16h，光照强度5000lx）。
将高5cm左右的再生苗移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14h。有2～3个分蘖时，将幼苗从花盆中取出，流水洗净根部，修剪幼苗，使根长或叶长保留3cm左右。将修剪好的幼苗根部完全浸入含有不同浓度DMSO的0.2%的秋水仙碱加倍液中，18℃恒温培养。通气装置采用普通鱼缸通氧机。将处理完毕的幼苗，流水冲洗根部3h，移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14h，待新蘖产生时，转移到17～25℃的环境中，直至成熟收获，即为T0代植株。
1.5转基因植株GUS染色
GUS组织染色液的配制：0.2mol/L磷酸钠缓冲液1ml；0.1mol/L亚铁氰化钾和0.1mol/L铁氰化钾各1ml；0.5mol/LNa2-EDTA8ml；200mgX-gluc溶于400μlDMSO中；加水定容至200ml。
GUS组织染色：取待检测组织，剪断或切开后分别放入5ml离心管中，用GUS染色液完全浸没，37℃振荡过夜，次日用70%乙醇冲洗2～3次，观察染色结果。
1.6转基因植株纯合体验证
为验证转基因植株是否为纯合，对T0代植株和来自同一个T0代单株的10个T1代植株进行PCR检测，检测对象为GUS基因。正向引物为5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′，反向引物为5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′，PCR产物长度为616bp。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。 2结果与分析
2.1不同金粉浓度和轰击压力对转化效率的影响
本试验首先设计3个轰击压力和3个金粉浓度，进行9个试验处理，每个处理转化花药2000个，具体结果见表1。
从表1可以看出，在花药数目相同的情况下，900psi的轰击压力下，3个金粉浓度都没有得到阳性植株；1100psi的轰击压力下，每枪金粉用量为60μg时得到3个阳性植株，每枪金粉用量为100μg时，得到5个阳性植株，其转化效率分别为0.15%和0.25%；而在1300psi的轰击压力下，3个浓度的金粉都得到阳性植株，其中每枪用量为100μg时转化效率最高，达到0.60%。
2.2不同金粉粒度对转化效率的影响
依据上述试验数据，确定了1300psi轰击压力和每枪100μg的金粉用量为适宜参数，在培养条件和轰击压力、金粉浓度等轰击参数不变的情况下，对0.6μm和1.0μm两种不同粒度的金粉进行了转化效率试验，每个处理转化花药2000个。结果显示，0.6μm的金粉轰击花药获得胚状体652个，阳性植株9个，转化效率为0.45%；而1.0μm金粉轰击花药获得胚状体703个，阳性植株5个，转化效率为0.25%。
2.3不同轰击距离对转化效率的影响
在上述参数不变的情况下，设定6cm和9cm两个轰击距离，每个处理轰击花药2000个。其中轰击距离为6cm时，获得胚状体663个，阳性植株10个，转化效率为0.50%；而轰击距离9cm时，获得胚状体861个，没有阳性植株。
根据上述3个试验获得的数据，确定金粉粒度0.6μm、每枪金粉用量100μg、轰击距离6cm、轰击压力1300psi为花药转化的最佳参数组合。
2.4通气方式和不同修剪方式对加倍效率的影响
如表2所示，当单倍体植株根和叶都被修剪至3cm左右时，通气情况下，植株存活率和加倍效率都达到100%；不通气时，只有76株存活，存活率为84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部时，两种情况下的加倍效率与根叶皆剪时没有明显差别，分别为99.9%和83.3%。但是，只作修剪叶片而不剪根时，植株的加倍效率明显降低，两种情况下的加倍效率分别为62.2%和57.8%。如果根叶都不剪，通气时的加倍效率为45.6%，不通气时为44.5%。因此，单倍体的加倍效率受通气和修剪方式的双重影响，通气可以极大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。
2.5不同DMSO浓度和处理时间对加倍效率的影响
将具有2～3个分蘖的单倍体植株的根和叶分别修剪至3cm左右，在含有不同浓度DMSO的0.2%的秋水仙碱溶液中分别加倍处理4、8、12h。如表3所示，DMSO浓度和处理时间对植株的存活率有明显影响，但对收获指数影响不明显。在含有5%DMSO的秋水仙碱溶液中处理4h或8h，单倍体加倍效率均最高，为100%，其中以4h为最佳处理时间；用含1%DMSO的溶液处理12h，加倍效率最低，为62.2%。
3结论与讨论
3.1金粉粒度、浓度和轰击压力、距离对转化效率的影响
自基因枪转化方法发明以来，针对不同作物和组织的转化参数已经建立[11，12]。就小麦而言，对诱导后愈伤组织的转化体系已经有了非常系统的研究，金粉粒度1μm、每枪30μg、轰击距离9cm是幼胚转化常用的参数[13，14]。本试验首次对基因枪转化花药的参数进行了研究，结果表明金粉粒度0.6μm、每枪100μg、轰击距离6cm是基因枪转化花药的最佳参数。不同组织之间转化参数的差异，可能与外植体的细胞结构有关。花药是一个高度发达的器官，外面一层是花药壁，里面包被着无数微小的小孢子，转化花药所产生的单倍体转基因植株实际上是由小孢子分化产生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉颗粒更相配，因此，0.6μm的金粉转化效率更高。而相对坚硬的花药壁需要比愈伤组织更大的冲击力，因此，6cm的轰击距离、1300psi的轰击压力转化效率更高。
3.2植株修剪方式、通气、DMSO浓度和处理时间对染色体加倍效率的影响
单倍体诱导和染色体加倍是花药培养的两个关键步骤。在这一过程中，基因型、培养基、培养环境对诱导效率和再生能力都有非常大的影响，随后的单倍体加倍过程又受单倍体生长状态、加倍药剂的种类和处理方式等多种因素的影响[9]。小麦的花药培养自20世纪60年代成功以来，已有大量关于提高愈伤诱导效率和单倍体加倍效率的研究，秋水仙碱是应用最为广泛的加倍剂，通常用法为用0.1%～0.2%的秋水仙碱处理几个小时，但是加倍效率在不同的报道中差异很大，而且往往伴随着较高的死苗率[15，16]。DMSO具有稳定细胞骨架、免受外来因素损伤的作用。本试验中5%DMSO处理提高了植株存活率，进一步证实了DMSO对细胞的保护作用。随着处理时间的延长，不同浓度DSMO处理的植株存活率均明显降低，表明秋水仙碱的积累会严重影响植株存活率。本试验结果显示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙碱溶液中，处理根叶均经过修剪的单倍体植株4h，加倍效果最好。
关键词：小麦；转基因；受体；花药；染色体加倍
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0001-06
小麦是重要的粮食作物之一，小麦生产的可持续性对于保障粮食安全至关重要。然而，由于缺少高抗生物或非生物逆境的小麦种质资源，在有限的土地资源上进一步提高小麦产量异常艰难。转基因技术为利用异源基因改良小麦的抗逆性、实现种质资源创新的新突破提供了新的机遇[1]。
愈伤组织诱导和再生是小麦转基因的关键步骤，迄今为止，已成功用于小麦遗传转化的外植体有幼胚[2，3]、幼穗[4]、花药诱导后的胚状体[5，6]、小孢子[7]、成熟胚[8]等。这些外植体中，除了花药诱导后的胚状体和小孢子为单倍体外，其余皆是二倍体。由于小麦基因组庞大，含有42条染色体，转基因后代纯合过程较慢。而以单倍体为受体的转基因植株经过染色体加倍，可以在转化当代获得纯合株系，大大缩短出圃年限。影响染色体加倍效率的因素有很多，植株的发育状态、试剂的种类、处理时间等都会对加倍效率产生影响[9]。秋水仙碱是目前应用最为广泛的加倍剂，但处理不当会对植株产生致死性的伤害[10]。
到目前为止，未见有以小麦花药作为转基因受体的报道。以花药为受体的小麦转基因技术首先要获得转化的单倍体植株，然后经过染色体加倍得到可育的转基因后代。为了建立以小麦离体花药为受体的外源基因导入技术体系，探索高效的染色体加倍技术，本试验对影响小麦基因枪转化和单倍体加倍的因素进行了详细的研究，建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系。
1材料与方法
1.1质粒及试剂
本试验所用的质粒为pHAC25，由山东省农业科学院作物所分子生物学实验室保存。
质粒提取试剂盒购自天根生物；培养基配制所需的无机盐购自国药集团；维生素和抗生素以及激素、GUS染色所需的药品购自Sigma公司；金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自伯乐公司。
1.2花药的分离与预处理
花药供体品种为K35，是山东省农科院作物所自行选育的具有良好花药培养能力的高代小麦品系。显微镜下观察花药发育情况，选择单核靠边期的花药（图1A），放入盛有0.3mol/L甘露醇预处理液的培养皿中，每皿500粒，4℃放置约16h（图1B）。将浸泡完全的花药转移到诱导培养基上（培养皿下放有画有基因枪轰击圈的白纸），每皿500粒，用于基因枪转化。
1.3子弹制备与花药转化
取金粉10mg，70%乙醇冲洗，10000r/min离心1min，重复3次，加入1ml灭菌水振荡2min，制成终浓度为10μg/μl的金粉贮藏液。将金粉贮藏液充分涡旋，取100μl放入硅化的1.5ml离心管中，14000r/min离心30s，弃上清；加入50μl灭菌水悬浮金粉，在振荡器上边轻微振荡边加入1μg/μl的质粒10μl，再加入20μl新配制的0.1mol/L的亚精胺和50μl2.5mol/L的CaCl2，高速蜗旋3min，将离心管在冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清；加入无水乙醇750μl，高速蜗旋，冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清，用100μl无水乙醇悬浮。
将制备的子弹用基因枪轰击预处理后的花药。
1.4诱导培养与再生苗的筛选及染色体加倍
于无菌操作台中将轰击后的花药转移到花药愈伤诱导培养基上（图1C），32℃暗培养3d后，28℃暗培养约4周，获得胚状体（图1D）。将1～2mm左右的胚状体转移到含有5mg/Lbiolaphos的再生培养基上，25℃下进行再生筛选培养（每天光照16h，光照强度5000lx）。
将高5cm左右的再生苗移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14h。有2～3个分蘖时，将幼苗从花盆中取出，流水洗净根部，修剪幼苗，使根长或叶长保留3cm左右。将修剪好的幼苗根部完全浸入含有不同浓度DMSO的0.2%的秋水仙碱加倍液中，18℃恒温培养。通气装置采用普通鱼缸通氧机。将处理完毕的幼苗，流水冲洗根部3h，移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14h，待新蘖产生时，转移到17～25℃的环境中，直至成熟收获，即为T0代植株。
1.5转基因植株GUS染色
GUS组织染色液的配制：0.2mol/L磷酸钠缓冲液1ml；0.1mol/L亚铁氰化钾和0.1mol/L铁氰化钾各1ml；0.5mol/LNa2-EDTA8ml；200mgX-gluc溶于400μlDMSO中；加水定容至200ml。
GUS组织染色：取待检测组织，剪断或切开后分别放入5ml离心管中，用GUS染色液完全浸没，37℃振荡过夜，次日用70%乙醇冲洗2～3次，观察染色结果。
1.6转基因植株纯合体验证
为验证转基因植株是否为纯合，对T0代植株和来自同一个T0代单株的10个T1代植株进行PCR检测，检测对象为GUS基因。正向引物为5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′，反向引物为5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′，PCR产物长度为616bp。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。 2结果与分析
2.1不同金粉浓度和轰击压力对转化效率的影响
本试验首先设计3个轰击压力和3个金粉浓度，进行9个试验处理，每个处理转化花药2000个，具体结果见表1。
从表1可以看出，在花药数目相同的情况下，900psi的轰击压力下，3个金粉浓度都没有得到阳性植株；1100psi的轰击压力下，每枪金粉用量为60μg时得到3个阳性植株，每枪金粉用量为100μg时，得到5个阳性植株，其转化效率分别为0.15%和0.25%；而在1300psi的轰击压力下，3个浓度的金粉都得到阳性植株，其中每枪用量为100μg时转化效率最高，达到0.60%。
2.2不同金粉粒度对转化效率的影响
依据上述试验数据，确定了1300psi轰击压力和每枪100μg的金粉用量为适宜参数，在培养条件和轰击压力、金粉浓度等轰击参数不变的情况下，对0.6μm和1.0μm两种不同粒度的金粉进行了转化效率试验，每个处理转化花药2000个。结果显示，0.6μm的金粉轰击花药获得胚状体652个，阳性植株9个，转化效率为0.45%；而1.0μm金粉轰击花药获得胚状体703个，阳性植株5个，转化效率为0.25%。
2.3不同轰击距离对转化效率的影响
在上述参数不变的情况下，设定6cm和9cm两个轰击距离，每个处理轰击花药2000个。其中轰击距离为6cm时，获得胚状体663个，阳性植株10个，转化效率为0.50%；而轰击距离9cm时，获得胚状体861个，没有阳性植株。
根据上述3个试验获得的数据，确定金粉粒度0.6μm、每枪金粉用量100μg、轰击距离6cm、轰击压力1300psi为花药转化的最佳参数组合。
2.4通气方式和不同修剪方式对加倍效率的影响
如表2所示，当单倍体植株根和叶都被修剪至3cm左右时，通气情况下，植株存活率和加倍效率都达到100%；不通气时，只有76株存活，存活率为84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部时，两种情况下的加倍效率与根叶皆剪时没有明显差别，分别为99.9%和83.3%。但是，只作修剪叶片而不剪根时，植株的加倍效率明显降低，两种情况下的加倍效率分别为62.2%和57.8%。如果根叶都不剪，通气时的加倍效率为45.6%，不通气时为44.5%。因此，单倍体的加倍效率受通气和修剪方式的双重影响，通气可以极大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。
2.5不同DMSO浓度和处理时间对加倍效率的影响
将具有2～3个分蘖的单倍体植株的根和叶分别修剪至3cm左右，在含有不同浓度DMSO的0.2%的秋水仙碱溶液中分别加倍处理4、8、12h。如表3所示，DMSO浓度和处理时间对植株的存活率有明显影响，但对收获指数影响不明显。在含有5%DMSO的秋水仙碱溶液中处理4h或8h，单倍体加倍效率均最高，为100%，其中以4h为最佳处理时间；用含1%DMSO的溶液处理12h，加倍效率最低，为62.2%。
3结论与讨论
3.1金粉粒度、浓度和轰击压力、距离对转化效率的影响
自基因枪转化方法发明以来，针对不同作物和组织的转化参数已经建立[11，12]。就小麦而言，对诱导后愈伤组织的转化体系已经有了非常系统的研究，金粉粒度1μm、每枪30μg、轰击距离9cm是幼胚转化常用的参数[13，14]。本试验首次对基因枪转化花药的参数进行了研究，结果表明金粉粒度0.6μm、每枪100μg、轰击距离6cm是基因枪转化花药的最佳参数。不同组织之间转化参数的差异，可能与外植体的细胞结构有关。花药是一个高度发达的器官，外面一层是花药壁，里面包被着无数微小的小孢子，转化花药所产生的单倍体转基因植株实际上是由小孢子分化产生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉颗粒更相配，因此，0.6μm的金粉转化效率更高。而相对坚硬的花药壁需要比愈伤组织更大的冲击力，因此，6cm的轰击距离、1300psi的轰击压力转化效率更高。
3.2植株修剪方式、通气、DMSO浓度和处理时间对染色体加倍效率的影响
单倍体诱导和染色体加倍是花药培养的两个关键步骤。在这一过程中，基因型、培养基、培养环境对诱导效率和再生能力都有非常大的影响，随后的单倍体加倍过程又受单倍体生长状态、加倍药剂的种类和处理方式等多种因素的影响[9]。小麦的花药培养自20世纪60年代成功以来，已有大量关于提高愈伤诱导效率和单倍体加倍效率的研究，秋水仙碱是应用最为广泛的加倍剂，通常用法为用0.1%～0.2%的秋水仙碱处理几个小时，但是加倍效率在不同的报道中差异很大，而且往往伴随着较高的死苗率[15，16]。DMSO具有稳定细胞骨架、免受外来因素损伤的作用。本试验中5%DMSO处理提高了植株存活率，进一步证实了DMSO对细胞的保护作用。随着处理时间的延长，不同浓度DSMO处理的植株存活率均明显降低，表明秋水仙碱的积累会严重影响植株存活率。本试验结果显示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙碱溶液中，处理根叶均经过修剪的单倍体植株4h，加倍效果最好。