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[摘 要]在学习《现代生物科技专题》胚胎工程内容的过程中，学生常会遇到较多的疑难问题。基于此，针对胚胎工程中的精子获能培养液成分、胚胎的冷冻保存、母牛是否妊娠的检查及饲养层细胞的有关疑难问题做进一步的解释，以帮助学生有效突破学习难点。
[关键词]胚胎工程；疑难问题；精子获能；冷冻保存；妊娠检查；饲养层细胞
[中图分类号] G633.91 [文献标识码] A [文章编号] 1674-6058（2018）20-0096-01
在《现代生物科技专题》之“胚胎工程”的学习中，有些内容较难理解，但教材只给出了实际的应用情况，对其原理并没有做进一步阐述，使学生产生疑问。本文就胚胎工程中的几个疑难问题进行了解释。
疑问1：精子为什么要获能？人工配制的获能液的主要成分是什么？化学培养法中为何要加入肝素或Ca2 离子载体？
精子获能的原理：成熟的精子本身具有受精能力，但由附睾分泌的物质附于精子表面（称为质膜），阻止了顶体酶的释放。精子获能是指精子质膜表面的糖蛋白被降解，同时质膜中胆固醇的量发生变化，质膜稳定性降低，顶体酶得以释放的过程。因此精子需要获能。
人工配制的获能液的成分：TYH精子获能液是为精子所配备的碳酸氢盐缓冲液，可在预备受精时满足精子获能的各种需要。组分主要有NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaHCO[-3]、CaCl2、丙酮酸钠、甲基-β-环糊精等。高浓度的HCO[-3]能够使质膜表面均匀分布的胆固醇集中到精子头部顶端，甲基-β-环糊精能够移去质膜上的胆固醇，从而破坏质膜的完整性，丙酮酸钠则作为能量的来源。
化学培养法中添加物质的作用：肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖。氨基多糖可通过结合和去除精子质膜上抑制获能的蛋白来刺激获能。“A23187”载体是一种移动性离子载体，加入到含有Ca2 的细胞培养液中，则Ca2 很快进入到细胞质内，Ca2 浓度升高可诱导顶体酶的活性。
疑问2：细胞在-196℃液氮中保存，细胞不会被冻死吗？
细胞被冷冻的过程可分为液晶态和玻璃态两种状态，由前者进入后者。目前，细胞冻存最常用的技術是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变；部分蛋白质变性，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分遭到破坏；线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍，细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡；等等。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜做保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。缓慢冷冻法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。因此，胚胎在 -196℃液氮中保存可以不被冻死。
疑问3：如何进行受体母牛的妊娠检查？
对母牛进行妊娠检查常用的方法有直肠检测法、阴道检查法、激素诊断法、看“眼线”法等，均在配种后25～30天后进行检查。课本图示的方法为直肠检测法。
直肠检测法：通过直肠内壁触摸卵巢上的黄体变化及子宫的变化来判断奶牛是否妊娠。母牛配种后30天检查，此时排卵侧卵巢体积增大到原来的1倍，同核桃大甚至鸡蛋大，质地较硬，黄体明显凸出于卵巢表面，而另一侧卵巢无变化；子宫角大于空角，增粗、质地松软，有波动感，触摸时无收缩反应，可判定为妊娠。阴道检查法：阴道黏膜苍白，无光泽；子宫颈口偏向一侧，呈闭锁状态，被灰暗浓稠的黏液所封闭。激素诊断法：用乙烯雌酚10 mg，一次肌肉注射。已妊娠者无发情表现；未妊娠者第2天便表现出明显发情。看“眼线”法：在瞳孔的正下方巩膜表面，有明显的纵向血管1～2条（个别也有3条的），呈直线状态，颜色深红，轮廓清晰，又没有任何发情表现，则为妊娠。
疑问4：什么是饲养层细胞？为什么它能够使细胞分裂而不分化？
饲养层细胞是经过射线照射或丝裂霉素C（有丝分裂阻断剂）处理后，用作克隆细胞附着底物且能产生多种营养因子的细胞。常见的饲养层细胞有颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等，饲养层细胞经有丝分裂阻断剂处理后虽然失去了分裂能力，但仍然保持生存能力。
在细胞体外培养中，先培养一层饲养层细胞，然后在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。饲养层细胞可为所培养的细胞提供它们在体外存活增殖所必需的生长因子，还会产生能抑制细胞自发性分化的多肽细胞因子，所以饲养层细胞可以使培养的细胞保持分裂而不分化的状态。
（责任编辑 黄春香）
[关键词]胚胎工程；疑难问题；精子获能；冷冻保存；妊娠检查；饲养层细胞
[中图分类号] G633.91 [文献标识码] A [文章编号] 1674-6058（2018）20-0096-01
在《现代生物科技专题》之“胚胎工程”的学习中，有些内容较难理解，但教材只给出了实际的应用情况，对其原理并没有做进一步阐述，使学生产生疑问。本文就胚胎工程中的几个疑难问题进行了解释。
疑问1：精子为什么要获能？人工配制的获能液的主要成分是什么？化学培养法中为何要加入肝素或Ca2 离子载体？
精子获能的原理：成熟的精子本身具有受精能力，但由附睾分泌的物质附于精子表面（称为质膜），阻止了顶体酶的释放。精子获能是指精子质膜表面的糖蛋白被降解，同时质膜中胆固醇的量发生变化，质膜稳定性降低，顶体酶得以释放的过程。因此精子需要获能。
人工配制的获能液的成分：TYH精子获能液是为精子所配备的碳酸氢盐缓冲液，可在预备受精时满足精子获能的各种需要。组分主要有NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaHCO[-3]、CaCl2、丙酮酸钠、甲基-β-环糊精等。高浓度的HCO[-3]能够使质膜表面均匀分布的胆固醇集中到精子头部顶端，甲基-β-环糊精能够移去质膜上的胆固醇，从而破坏质膜的完整性，丙酮酸钠则作为能量的来源。
化学培养法中添加物质的作用：肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖。氨基多糖可通过结合和去除精子质膜上抑制获能的蛋白来刺激获能。“A23187”载体是一种移动性离子载体，加入到含有Ca2 的细胞培养液中，则Ca2 很快进入到细胞质内，Ca2 浓度升高可诱导顶体酶的活性。
疑问2：细胞在-196℃液氮中保存，细胞不会被冻死吗？
细胞被冷冻的过程可分为液晶态和玻璃态两种状态，由前者进入后者。目前，细胞冻存最常用的技術是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变；部分蛋白质变性，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分遭到破坏；线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍，细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡；等等。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜做保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。缓慢冷冻法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。因此，胚胎在 -196℃液氮中保存可以不被冻死。
疑问3：如何进行受体母牛的妊娠检查？
对母牛进行妊娠检查常用的方法有直肠检测法、阴道检查法、激素诊断法、看“眼线”法等，均在配种后25～30天后进行检查。课本图示的方法为直肠检测法。
直肠检测法：通过直肠内壁触摸卵巢上的黄体变化及子宫的变化来判断奶牛是否妊娠。母牛配种后30天检查，此时排卵侧卵巢体积增大到原来的1倍，同核桃大甚至鸡蛋大，质地较硬，黄体明显凸出于卵巢表面，而另一侧卵巢无变化；子宫角大于空角，增粗、质地松软，有波动感，触摸时无收缩反应，可判定为妊娠。阴道检查法：阴道黏膜苍白，无光泽；子宫颈口偏向一侧，呈闭锁状态，被灰暗浓稠的黏液所封闭。激素诊断法：用乙烯雌酚10 mg，一次肌肉注射。已妊娠者无发情表现；未妊娠者第2天便表现出明显发情。看“眼线”法：在瞳孔的正下方巩膜表面，有明显的纵向血管1～2条（个别也有3条的），呈直线状态，颜色深红，轮廓清晰，又没有任何发情表现，则为妊娠。
疑问4：什么是饲养层细胞？为什么它能够使细胞分裂而不分化？
饲养层细胞是经过射线照射或丝裂霉素C（有丝分裂阻断剂）处理后，用作克隆细胞附着底物且能产生多种营养因子的细胞。常见的饲养层细胞有颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等，饲养层细胞经有丝分裂阻断剂处理后虽然失去了分裂能力，但仍然保持生存能力。
在细胞体外培养中，先培养一层饲养层细胞，然后在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。饲养层细胞可为所培养的细胞提供它们在体外存活增殖所必需的生长因子，还会产生能抑制细胞自发性分化的多肽细胞因子，所以饲养层细胞可以使培养的细胞保持分裂而不分化的状态。
（责任编辑 黄春香）