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[摘要] 目的 研究基于环磷酸腺苷（cAMP）信号通路分析微小RNA-7a2（miR-7a2）对青春期大鼠雄性生殖系统发育的影响。 方法 本研究选取2020年3—10月健康、清洁级Wistar雄性鼠龄3周大鼠30只，随机分为对照组（生理盐水）、miR-7a2上调组（超表达pmcherry-Flag-miR-7a2）、miR-7a2下调组（慢病毒质粒miR-7a2-sh RNA-1），每组各10只。检测三组激素水平，统计体重、睾丸重量、精子畸变、活动度，观察睾丸形态学，检测cAMP信号通路相关蛋白腺苷酸环化酶（AC）、磷酸二酯酶（PDE）、蛋白激酶（PK）。 結果 miR-7a2上调组miR-7a2表达高于对照组和miR-7a2下调组;miR-7a2下调组miR-7a2表达低于对照组（P<0.05）。miR-7a2上调组雌二醇、卵泡刺激素水平低于miR-7a2下调组;睾酮水平高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2上调组体重、睾丸重量、精子密度高于miR-7a2下调组，精子畸变率低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2上调组良好、一般精子活动度高于miR-7a2下调组;不良、死亡精子活动度低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2上调组AC蛋白表达低于miR-7a2下调组，PK蛋白表达高于miR-7a2下调组（P<0.05）。 结论 miR-7a2上调能促进青春期大鼠雄性生殖系统发育，其作用机制与cAMP信号通路有关。
[关键词] 环磷酸腺苷;微小RNA-7a2;青春期;生殖系统发育
[中图分类号] R691.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）24-0045-05
Effect of miR-7a2 on the development of the male reproductive system in adolescent rats based on the cAMP signaling pathway
XU Wei DU Erqiu
Department of Gynecology， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province （Taizhou University Hospital）， Taizhou 318000， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-7a2 （miR-7a2） on the development of the male reproductive system in adolescent rats based on the cyclic adenosine monophosphate （cAMP） signaling pathway. Methods Thirty healthy， clean Wistar male rats aged three weeks from to March to October 2020 were randomly divided into the control group （saline）， the miR-7a2 up-regulation group （overexpression of pmcherry-Flag-miR-7a2）， and miR-7a2 down-regulation group （lentiviral plasmid miR-7a2-shRNA-1）， with ten rats in each group. Hormone levels were detected. The body weight， testicular weight， sperm aberrations， and motility were measured. The testicular morphology was observed. The cAMP signaling pathway-related proteins adenylate cyclase （AC）， phosphodiesterase （PDE）， and protein kinase （PK） were measured. Results miR-7a2 expression was higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the control and miR-7a2 down-regulation groups. miR-7a2 expression was lower in the miR-7a2 down-regulation group than in the control group（P<0.05）. Estradiol and follicle-stimulating hormone levels were lower， and testosterone levels were higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. Body weight， testicular weight， and sperm density were higher， and sperm aberration rate was lower in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）.The excellent and general sperm motility in the miR-7a2 up-regulation group was higher than that in the miR-7a2 down-regulation group. The poor and dead sperm motility in the miR-7a2 up-regulation was lower than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. AC protein expression was lower， and PK protein expression was higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. Conclusion The up-regulation of miR-7a2 can promote the development of the male reproductive system in adolescent rats， and the mechanism is related to the cAMP signaling pathway. [Key words] Cyclic adenosine monophosphate; microRNA-7a2; Puberty; Reproductive system development
近年来研究数据显示，男性精子质量和数量呈下降趋势，前列腺癌、睾丸癌患者人数增加，其受环境分泌物的影响较大[1-2]。成熟精子产生与睾丸中细胞分化形成精原细胞，经过复杂有丝分裂有关，研究指出精子形成过程受染色体、基因程序表达、内源性调节因子等影响，目前临床中缺少关于精子的发生机制[3]。微小RNA-7（microRNA-7，miR-7）水平与生殖疾病有关，有研究指出，在非梗阻性无精子患者中，miR-7-1-3p水平表达较高[4]，miR-7表达降低会影响生殖细胞分化[5]，提示miR-7参与睾丸生殖细胞过程。卵泡刺激素、黄体生成素对睾酮分泌有重要的调节作用，同时受环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路调控[6]。本研究旨在探讨基于cAMP信号通路研究miR-7a2对青春期大鼠雄性生殖系统发育的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 材料
选取2020年3—10月期间健康、清洁级Wistar雄性大鼠30只，体重（85.00±4.50）g，均由华北理工大学提供，SYXK（冀）2020-007。鼠龄为3周。所有大鼠均给予常规饲养，自由饮食饮水，饲养温度20℃～25℃，湿度设置50%左右。
1.2 方法
1.2.1 分组及干预 30只模型大鼠随机分为对照组、miR-7a2上调组、miR-7a2下调组，每组各10只。miR-7a2上调转染miR-7a2实现，100 nmoL/L转染miRNA抑制剂超表达pmcherry-Flag-miR-7a2，设为miR-7a2上调组;miR-7a2下调组使用100 nM转慢病毒质粒miR-7a2-sh RNA-1干预，均由广州锐博生物科技有限公司提供。对照组给予等体积生理盐水干预。
1.2.2 miR-7a2检测 取大鼠尾部静脉血3 mL，3000 r/min离心10 min，取上层血清，放置于-20℃冰箱内备用。实时荧光定量PCR操作步骤：将100 μL血清置于300 μL Trizol中震荡混匀，静置10 min，滴加80 μL氯仿再次震荡混匀后静置5 min，离心处理凝胶，滴加二乙基焦碳酸酯（Diethylprocarbonate）1 mL。将标本混合液离心处理15 min，提取上清置于含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。白色沉淀中滴加75%乙醇（1 mL），混匀，洗涤RNA沉淀，4℃ 7500 g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μL DEPC水RNA沉淀溶解，保存。采用逆转录试剂盒（TaqManR miRNA reverse transcription kit）逆转成cDNA，严格按照操作说明书进行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，以外源性cel-miR-39-3p作参照，采用2-ΔΔCT法对miR-7a2表达水平进行分析。
1.2.3 激素水平检测及体重、睾丸重量统计 通过放射免疫分析法检测雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮水平，严格按照试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，货号：XFFM180）操作说明步骤操作。称量各组大鼠体重、睾丸重量。
1.2.4 精子畸变、活动度统计及形态学观察 大鼠麻醉处死后，提取附睾组织，将其纵向切开后，置入4 mL的生理盐水中，预热处理，将组织碎片清除，恒温箱中培育。提取0.01 mL的精子悬液，在显微镜下观察精子的精子密度、精子畸变率。精子活动度评估标准参考文献[7]：良好：精子活动良好，直线游动;一般：精子活泼，游动方向不定，不呈直线;不良：精子游动迟缓，原地打转;死亡：大鼠精子无活力，但有精子形。提取大鼠睾丸组织，生理盐水冲洗后，将粘附在其表现的异物清除干净，干净纱布将表面水分吸干后制备切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，染色15 min后使用生理盐水冲洗干净，计算大鼠心肌梗死面积。之后切片经过二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。
1.2.5 cAMP信号通路相关蛋白检测 采用免疫印迹（Western blot）将标本提取液，通过1000 rpm离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000 rpm离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase，AC）、磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）、蛋白激酶（Protein kinase，PK）蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5 μL Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳;转膜成功后将硝酸纤维素膜（Nitrocellulosefilter membrane，NC）在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗（AC、cAMP、PDE、PK 1：1000）孵育，经过震荡洗膜后加二抗（AC、cAMP、PDE、PK 1：10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用红外荧光成像系统对结果进行分析，以GAPDH为内参。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计学软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠miR-7a2表达比较 miR-7a2上调组miR-7a2表达（1.38±0.22）高于对照组（1.00±0.10）和miR-7a2下调组（0.82±0.08）;miR-7a2下调组miR-7a2表达低于对照组（P<0.05）。见图1。
2.2 各组大鼠激素水平比较
miR-7a2上调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于对照组，低于miR-7a2下调组;睾酮水平低于对照组，高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于高于对照组，睾酮水平低于对照组（P<0.05）。三组黄体生成素水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.3 各组大鼠体重、睾丸重量比较
miR-7a2上调组体重、睾丸重量低于对照组，高于miR-7a2下调组;miR-7a2下调组体重、睾丸重量低于对照组（P<0.05）。见表2。
2.4 各组大鼠精子密度、精子畸变、活动度比较
miR-7a2上调组精子密度低于对照组，高于miR-7a2下调组;精子畸变率高于对照组，低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组精子密度低于对照组，精子畸变率高于对照组（P<0.05）。见表3。
miR-7a2上调组良好、一般精子活动度低于对照组，高于miR-7a2下调组;不良、死亡精子活动度高于对照组，低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组良好、一般精子活动度低于对照组，不良、死亡精子活动度高于对照组（P<0.05）。見表4。
对照组大鼠精子数量较多，细胞排列紧密整齐，细胞质颜色较深，细胞核表现明显;睾丸间质细胞整齐分布，结构完整。miR-7a2下调组精子、睾丸间质细胞数量减少，细胞结构被破坏，细胞表现为褶皱，细胞核发生固缩。miR-7a2上调组精子、睾丸间质细胞数量增加，细胞结构、形态改善。见封三图3。
2.5 各组大鼠cAMP信号通路相关蛋白表达比较
miR-7a2上调组、对照组AC、PK蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。miR-7a2上调组、对照组AC蛋白表达低于miR-7a2下调组，PK蛋白表达高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2上调组cAMP蛋白表达高于对照组和miR-7a2下调组;PDE蛋白表达低于对照组，高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组cAMP、PDE蛋白表达低于对照组（P<0.05）。见表5、图2。
3 讨论
青春期是儿童成长发育的重要时期，伴随着角色的转变，在青春期，大脑脑垂体会分泌大量激素，对性腺刺激分泌性激素，引起各种生理变化[8-9]。青春期性成熟发育速度及开始时间受自身、环境、调控因子网络共同影响，目前研究显示，全球范围内儿童青春期开始时间提前[10]。
越来越多的研究证实，miRNA维持生殖功能，参与卵母细胞成熟过程，同时维持黄体功，在培养置入、早期胚胎发育中均有重要的参与功能[11-12]。miR-7水平高低与乳腺癌、卵巢癌、精子缺失有关[13]。Ahmed等[14]研究证实，miR-7a2较为保守，其一旦被敲除会导致雌性小鼠不育。本研究结果显示，miR-7a2上调组miR-7a2水平显著升高。雄性动物生殖能力主要与下丘脑-垂体-睾丸轴有关，研究显示当进入青春期，下丘脑会降低对睾酮负反馈的敏感作用，释放大量的促性腺激素，分泌大量的促卵泡激素和黄体生成素，黄体生成素通过刺激睾丸间质细胞产生睾酮，有助于性器官发育[15-16]。雄性动物体内雌二醇水平受睾酮的影响，雌二醇水平异常会抑制睾酮合成。本研究结果显示，miR-7a2上调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于对照组，低于miR-7a2下调组，雌二醇含量升高会将机体中雌-雄激素平衡破坏，降低睾酮水平，因此miR-7a2上调组睾酮水平低于对照组，高于miR-7a2下调组。miR-7a2上调有助于维持大鼠性激素平衡，miR-7a2下调会导致大鼠雌-雄激素失衡。
本研究结果显示，miR-7a2下调组大鼠体重、睾丸重量降低，miR-7a2上调会增加大鼠体重、睾丸重量。提示miR-7a2下调会一定程度上抑制大鼠睾丸发育，减轻大鼠体重。精子密度、精子活动度及精子畸形率是判断精子质量的重要评估标准，精子数量、形态、活动能力对生殖能力有明显的决定作用，一旦精子数量减少，会导致精细胞发育、生殖损伤[17-18]。本文研究结果显示，miR-7a2下调组精子密度、精子畸变率以及良好、一般精子活动度均降低，经过miR-7a2上调，大鼠精子密度增加，精子畸变率降低，良好、一般精子活动度有所提高。
cAMP信号通路在哺乳动物精液活力、精卵结合等过程中具有重要意义，通过与G蛋白偶联受体结合，刺激细胞膜上Gs蛋白活性，引起细胞膜发生变化，促进AC水解，产生cAMP蛋白，从而影响PK蛋白活性[19-20]。江峰等[21]研究也指出，激活PK蛋白会促进多种靶蛋白发生磷酸化，影响蛋白活性变化，参与精子形成过程。本研究结果显示，与miR-7a2下调组比较，miR-7a2上调能提高cAMP、PDE蛋白表达，维持AC、PK蛋白表达水平稳定。
综上所述，miR-7a2上调通过调控cAMP信号通路及其相关蛋白，能改善青春期雄性大鼠激素水平和精子活动度，从而促进大鼠生殖系统发育，为临床研究精子形成过程提高理论依据。
[参考文献]
[1] 吴剑锋.男性基础性激素水平与精子质量参数的相关性探讨[J].现代检验医学杂志，2020，35（3）：69-71，77.
[2] 苟江，赵军，赵静，等.男性体质指数对精子质量及性激素水平影响的Meta分析[J].现代泌尿外科杂志，2019， 24（6）：461-466. [3] 马帅，代晓微.畸形精子症相关基因研究进展[J].中华男科学杂志，2018，24（10）：937-940.
[4] Mokánszki A，Molnár Z，Varga Tóthné E，et al. Altered microRNAs expression levels of sperm and seminal plasma in patients with infertile ejaculates compared with normozoospermic males[J].Hum Fertil （Camb），2020，23（4）：246-255.
[5] 向光明，劉秋月，王翔宇，等.microRNA对动物生殖轴以及胚胎着床影响的研究进展[J].中国畜牧杂志，2019， 55（1）：1-8.
[6] Gilchrist RB，Luciano AM，Richani D，et al. Oocyte maturation and quality：Role of cyclic nucleotides[J]. Reproduction，2016，152（5）：R143-157.
[7] 马军建，张浩军，张珂，等.甲状腺功能减退对雄性大鼠精子活动度的影响[J].中华地方病学杂志，2013，32（4）：362-364.
[8] 李恩荆，刘大庆，张一民，等.不同发育水平儿童少年力量素质与激素水平的变化规律与关联分析[J].武汉体育学院学报，2019，53（3）：50-57.
[9] 贺璟，张善辉，王平平.下丘脑和垂体微小RNAs调控生殖功能的研究进展[J].中华生殖与避孕杂志，2019， 39（5）：417-421.
[10] Reese BM，Trinh SL，Halpern CT.Implications of pubertal timing for romantic relationship quality among heterosexual and sexual minority young adults[J]. J Adolesc Health，2017，61（6）：685-693.
[11] Salas-Huetos A，James ER，Aston KI，et al. The role of miRNAs in male human reproduction：A systematic review[J].Andrology，2020，8（1）：7-26.
[12] Chen L，Zhang BY，Feng GD，et al. The mechanism of miRNA-mediated PGR signaling pathway in regulating female reproduction[J]. Yi Chuan，2016，38（1）：40-51.
[13] Crowley WF，Balasubramanian R.MicroRNA-7a2 suppression causes hypogonadotropism and uncovers signaling pathways in gonadotropes[J].J Clin Invest，2017，127（3）：796-797.
[14] Ahmed K，LaPierre MP，Gasser E，et al. Loss of microRNA-7a2 induces hypogonadotropic hypogonadism and infertility[J]. J Clin Invest， 2017，127（3）：1061-1074.
[15] 段晓楠，严双琴，汪素美，等.下丘脑-垂体-肾上腺轴昼夜节律指标随青春期发育变化的特征[J].中华流行病学杂志，2018，39（8）：1086-1090.
[16] 徐耿，韩阿珠，许诺，等.孕期双酚A暴露对子代雌鼠青春期发育提前及下丘脑-垂体-性腺轴激素水平的影响[J].卫生研究，2018，47（3）：425-431.
[17] 张莹莹，刘天龙，余锐萍，等.青春期前双酚A暴露对雌性大鼠生殖器官发育的影响[J].中国兽医杂志，2020， 56（2）：89-92，97，中插6.
[18] 张宁，郑群，傅晓艳，等.人工光照对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017，26（5）：451-455.
[19] Azevedo MF，Horvath A，Bornstein ER，et al.Cyclic AMP and c-KIT signaling in familial testicular germ cell tumor predisposition[J]. J Clin Endocrinol Metab，2013，98（8）：E1393-1400.
[20] 陈云蕾，吴雨红，赵新霞，等.NYD-SP27基因对绵羊精子质量及精子中cAMP信号通路的影响[J].畜牧与兽医，2020，52（2）：18-22.
[21] 江峰，朱勇，陈颖，等.孕酮通过ABHD2受体介导的cAMP-PKA信号通路调控精子受精功能的研究[J].中国男科学杂志，2020，34（6）：12-16.
（收稿日期：2021-04-07）
[关键词] 环磷酸腺苷;微小RNA-7a2;青春期;生殖系统发育
[中图分类号] R691.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2021）24-0045-05
Effect of miR-7a2 on the development of the male reproductive system in adolescent rats based on the cAMP signaling pathway
XU Wei DU Erqiu
Department of Gynecology， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province （Taizhou University Hospital）， Taizhou 318000， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-7a2 （miR-7a2） on the development of the male reproductive system in adolescent rats based on the cyclic adenosine monophosphate （cAMP） signaling pathway. Methods Thirty healthy， clean Wistar male rats aged three weeks from to March to October 2020 were randomly divided into the control group （saline）， the miR-7a2 up-regulation group （overexpression of pmcherry-Flag-miR-7a2）， and miR-7a2 down-regulation group （lentiviral plasmid miR-7a2-shRNA-1）， with ten rats in each group. Hormone levels were detected. The body weight， testicular weight， sperm aberrations， and motility were measured. The testicular morphology was observed. The cAMP signaling pathway-related proteins adenylate cyclase （AC）， phosphodiesterase （PDE）， and protein kinase （PK） were measured. Results miR-7a2 expression was higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the control and miR-7a2 down-regulation groups. miR-7a2 expression was lower in the miR-7a2 down-regulation group than in the control group（P<0.05）. Estradiol and follicle-stimulating hormone levels were lower， and testosterone levels were higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. Body weight， testicular weight， and sperm density were higher， and sperm aberration rate was lower in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）.The excellent and general sperm motility in the miR-7a2 up-regulation group was higher than that in the miR-7a2 down-regulation group. The poor and dead sperm motility in the miR-7a2 up-regulation was lower than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. AC protein expression was lower， and PK protein expression was higher in the miR-7a2 up-regulation group than in the miR-7a2 down-regulation group（P<0.05）. Conclusion The up-regulation of miR-7a2 can promote the development of the male reproductive system in adolescent rats， and the mechanism is related to the cAMP signaling pathway. [Key words] Cyclic adenosine monophosphate; microRNA-7a2; Puberty; Reproductive system development
近年来研究数据显示，男性精子质量和数量呈下降趋势，前列腺癌、睾丸癌患者人数增加，其受环境分泌物的影响较大[1-2]。成熟精子产生与睾丸中细胞分化形成精原细胞，经过复杂有丝分裂有关，研究指出精子形成过程受染色体、基因程序表达、内源性调节因子等影响，目前临床中缺少关于精子的发生机制[3]。微小RNA-7（microRNA-7，miR-7）水平与生殖疾病有关，有研究指出，在非梗阻性无精子患者中，miR-7-1-3p水平表达较高[4]，miR-7表达降低会影响生殖细胞分化[5]，提示miR-7参与睾丸生殖细胞过程。卵泡刺激素、黄体生成素对睾酮分泌有重要的调节作用，同时受环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路调控[6]。本研究旨在探讨基于cAMP信号通路研究miR-7a2对青春期大鼠雄性生殖系统发育的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 材料
选取2020年3—10月期间健康、清洁级Wistar雄性大鼠30只，体重（85.00±4.50）g，均由华北理工大学提供，SYXK（冀）2020-007。鼠龄为3周。所有大鼠均给予常规饲养，自由饮食饮水，饲养温度20℃～25℃，湿度设置50%左右。
1.2 方法
1.2.1 分组及干预 30只模型大鼠随机分为对照组、miR-7a2上调组、miR-7a2下调组，每组各10只。miR-7a2上调转染miR-7a2实现，100 nmoL/L转染miRNA抑制剂超表达pmcherry-Flag-miR-7a2，设为miR-7a2上调组;miR-7a2下调组使用100 nM转慢病毒质粒miR-7a2-sh RNA-1干预，均由广州锐博生物科技有限公司提供。对照组给予等体积生理盐水干预。
1.2.2 miR-7a2检测 取大鼠尾部静脉血3 mL，3000 r/min离心10 min，取上层血清，放置于-20℃冰箱内备用。实时荧光定量PCR操作步骤：将100 μL血清置于300 μL Trizol中震荡混匀，静置10 min，滴加80 μL氯仿再次震荡混匀后静置5 min，离心处理凝胶，滴加二乙基焦碳酸酯（Diethylprocarbonate）1 mL。将标本混合液离心处理15 min，提取上清置于含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。白色沉淀中滴加75%乙醇（1 mL），混匀，洗涤RNA沉淀，4℃ 7500 g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μL DEPC水RNA沉淀溶解，保存。采用逆转录试剂盒（TaqManR miRNA reverse transcription kit）逆转成cDNA，严格按照操作说明书进行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，以外源性cel-miR-39-3p作参照，采用2-ΔΔCT法对miR-7a2表达水平进行分析。
1.2.3 激素水平检测及体重、睾丸重量统计 通过放射免疫分析法检测雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮水平，严格按照试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，货号：XFFM180）操作说明步骤操作。称量各组大鼠体重、睾丸重量。
1.2.4 精子畸变、活动度统计及形态学观察 大鼠麻醉处死后，提取附睾组织，将其纵向切开后，置入4 mL的生理盐水中，预热处理，将组织碎片清除，恒温箱中培育。提取0.01 mL的精子悬液，在显微镜下观察精子的精子密度、精子畸变率。精子活动度评估标准参考文献[7]：良好：精子活动良好，直线游动;一般：精子活泼，游动方向不定，不呈直线;不良：精子游动迟缓，原地打转;死亡：大鼠精子无活力，但有精子形。提取大鼠睾丸组织，生理盐水冲洗后，将粘附在其表现的异物清除干净，干净纱布将表面水分吸干后制备切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中，染色15 min后使用生理盐水冲洗干净，计算大鼠心肌梗死面积。之后切片经过二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化，苏木精染色5 min，流水冲洗后给予伊红染色30 s，观察。
1.2.5 cAMP信号通路相关蛋白检测 采用免疫印迹（Western blot）将标本提取液，通过1000 rpm离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000 rpm离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase，AC）、磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）、蛋白激酶（Protein kinase，PK）蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5 μL Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳;转膜成功后将硝酸纤维素膜（Nitrocellulosefilter membrane，NC）在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗（AC、cAMP、PDE、PK 1：1000）孵育，经过震荡洗膜后加二抗（AC、cAMP、PDE、PK 1：10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用红外荧光成像系统对结果进行分析，以GAPDH为内参。
1.3 统计学方法
采用SPSS 25.0统计学软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠miR-7a2表达比较 miR-7a2上调组miR-7a2表达（1.38±0.22）高于对照组（1.00±0.10）和miR-7a2下调组（0.82±0.08）;miR-7a2下调组miR-7a2表达低于对照组（P<0.05）。见图1。
2.2 各组大鼠激素水平比较
miR-7a2上调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于对照组，低于miR-7a2下调组;睾酮水平低于对照组，高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于高于对照组，睾酮水平低于对照组（P<0.05）。三组黄体生成素水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.3 各组大鼠体重、睾丸重量比较
miR-7a2上调组体重、睾丸重量低于对照组，高于miR-7a2下调组;miR-7a2下调组体重、睾丸重量低于对照组（P<0.05）。见表2。
2.4 各组大鼠精子密度、精子畸变、活动度比较
miR-7a2上调组精子密度低于对照组，高于miR-7a2下调组;精子畸变率高于对照组，低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组精子密度低于对照组，精子畸变率高于对照组（P<0.05）。见表3。
miR-7a2上调组良好、一般精子活动度低于对照组，高于miR-7a2下调组;不良、死亡精子活动度高于对照组，低于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组良好、一般精子活动度低于对照组，不良、死亡精子活动度高于对照组（P<0.05）。見表4。
对照组大鼠精子数量较多，细胞排列紧密整齐，细胞质颜色较深，细胞核表现明显;睾丸间质细胞整齐分布，结构完整。miR-7a2下调组精子、睾丸间质细胞数量减少，细胞结构被破坏，细胞表现为褶皱，细胞核发生固缩。miR-7a2上调组精子、睾丸间质细胞数量增加，细胞结构、形态改善。见封三图3。
2.5 各组大鼠cAMP信号通路相关蛋白表达比较
miR-7a2上调组、对照组AC、PK蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。miR-7a2上调组、对照组AC蛋白表达低于miR-7a2下调组，PK蛋白表达高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2上调组cAMP蛋白表达高于对照组和miR-7a2下调组;PDE蛋白表达低于对照组，高于miR-7a2下调组（P<0.05）。miR-7a2下调组cAMP、PDE蛋白表达低于对照组（P<0.05）。见表5、图2。
3 讨论
青春期是儿童成长发育的重要时期，伴随着角色的转变，在青春期，大脑脑垂体会分泌大量激素，对性腺刺激分泌性激素，引起各种生理变化[8-9]。青春期性成熟发育速度及开始时间受自身、环境、调控因子网络共同影响，目前研究显示，全球范围内儿童青春期开始时间提前[10]。
越来越多的研究证实，miRNA维持生殖功能，参与卵母细胞成熟过程，同时维持黄体功，在培养置入、早期胚胎发育中均有重要的参与功能[11-12]。miR-7水平高低与乳腺癌、卵巢癌、精子缺失有关[13]。Ahmed等[14]研究证实，miR-7a2较为保守，其一旦被敲除会导致雌性小鼠不育。本研究结果显示，miR-7a2上调组miR-7a2水平显著升高。雄性动物生殖能力主要与下丘脑-垂体-睾丸轴有关，研究显示当进入青春期，下丘脑会降低对睾酮负反馈的敏感作用，释放大量的促性腺激素，分泌大量的促卵泡激素和黄体生成素，黄体生成素通过刺激睾丸间质细胞产生睾酮，有助于性器官发育[15-16]。雄性动物体内雌二醇水平受睾酮的影响，雌二醇水平异常会抑制睾酮合成。本研究结果显示，miR-7a2上调组雌二醇、卵泡刺激素水平高于对照组，低于miR-7a2下调组，雌二醇含量升高会将机体中雌-雄激素平衡破坏，降低睾酮水平，因此miR-7a2上调组睾酮水平低于对照组，高于miR-7a2下调组。miR-7a2上调有助于维持大鼠性激素平衡，miR-7a2下调会导致大鼠雌-雄激素失衡。
本研究结果显示，miR-7a2下调组大鼠体重、睾丸重量降低，miR-7a2上调会增加大鼠体重、睾丸重量。提示miR-7a2下调会一定程度上抑制大鼠睾丸发育，减轻大鼠体重。精子密度、精子活动度及精子畸形率是判断精子质量的重要评估标准，精子数量、形态、活动能力对生殖能力有明显的决定作用，一旦精子数量减少，会导致精细胞发育、生殖损伤[17-18]。本文研究结果显示，miR-7a2下调组精子密度、精子畸变率以及良好、一般精子活动度均降低，经过miR-7a2上调，大鼠精子密度增加，精子畸变率降低，良好、一般精子活动度有所提高。
cAMP信号通路在哺乳动物精液活力、精卵结合等过程中具有重要意义，通过与G蛋白偶联受体结合，刺激细胞膜上Gs蛋白活性，引起细胞膜发生变化，促进AC水解，产生cAMP蛋白，从而影响PK蛋白活性[19-20]。江峰等[21]研究也指出，激活PK蛋白会促进多种靶蛋白发生磷酸化，影响蛋白活性变化，参与精子形成过程。本研究结果显示，与miR-7a2下调组比较，miR-7a2上调能提高cAMP、PDE蛋白表达，维持AC、PK蛋白表达水平稳定。
综上所述，miR-7a2上调通过调控cAMP信号通路及其相关蛋白，能改善青春期雄性大鼠激素水平和精子活动度，从而促进大鼠生殖系统发育，为临床研究精子形成过程提高理论依据。
[参考文献]
[1] 吴剑锋.男性基础性激素水平与精子质量参数的相关性探讨[J].现代检验医学杂志，2020，35（3）：69-71，77.
[2] 苟江，赵军，赵静，等.男性体质指数对精子质量及性激素水平影响的Meta分析[J].现代泌尿外科杂志，2019， 24（6）：461-466. [3] 马帅，代晓微.畸形精子症相关基因研究进展[J].中华男科学杂志，2018，24（10）：937-940.
[4] Mokánszki A，Molnár Z，Varga Tóthné E，et al. Altered microRNAs expression levels of sperm and seminal plasma in patients with infertile ejaculates compared with normozoospermic males[J].Hum Fertil （Camb），2020，23（4）：246-255.
[5] 向光明，劉秋月，王翔宇，等.microRNA对动物生殖轴以及胚胎着床影响的研究进展[J].中国畜牧杂志，2019， 55（1）：1-8.
[6] Gilchrist RB，Luciano AM，Richani D，et al. Oocyte maturation and quality：Role of cyclic nucleotides[J]. Reproduction，2016，152（5）：R143-157.
[7] 马军建，张浩军，张珂，等.甲状腺功能减退对雄性大鼠精子活动度的影响[J].中华地方病学杂志，2013，32（4）：362-364.
[8] 李恩荆，刘大庆，张一民，等.不同发育水平儿童少年力量素质与激素水平的变化规律与关联分析[J].武汉体育学院学报，2019，53（3）：50-57.
[9] 贺璟，张善辉，王平平.下丘脑和垂体微小RNAs调控生殖功能的研究进展[J].中华生殖与避孕杂志，2019， 39（5）：417-421.
[10] Reese BM，Trinh SL，Halpern CT.Implications of pubertal timing for romantic relationship quality among heterosexual and sexual minority young adults[J]. J Adolesc Health，2017，61（6）：685-693.
[11] Salas-Huetos A，James ER，Aston KI，et al. The role of miRNAs in male human reproduction：A systematic review[J].Andrology，2020，8（1）：7-26.
[12] Chen L，Zhang BY，Feng GD，et al. The mechanism of miRNA-mediated PGR signaling pathway in regulating female reproduction[J]. Yi Chuan，2016，38（1）：40-51.
[13] Crowley WF，Balasubramanian R.MicroRNA-7a2 suppression causes hypogonadotropism and uncovers signaling pathways in gonadotropes[J].J Clin Invest，2017，127（3）：796-797.
[14] Ahmed K，LaPierre MP，Gasser E，et al. Loss of microRNA-7a2 induces hypogonadotropic hypogonadism and infertility[J]. J Clin Invest， 2017，127（3）：1061-1074.
[15] 段晓楠，严双琴，汪素美，等.下丘脑-垂体-肾上腺轴昼夜节律指标随青春期发育变化的特征[J].中华流行病学杂志，2018，39（8）：1086-1090.
[16] 徐耿，韩阿珠，许诺，等.孕期双酚A暴露对子代雌鼠青春期发育提前及下丘脑-垂体-性腺轴激素水平的影响[J].卫生研究，2018，47（3）：425-431.
[17] 张莹莹，刘天龙，余锐萍，等.青春期前双酚A暴露对雌性大鼠生殖器官发育的影响[J].中国兽医杂志，2020， 56（2）：89-92，97，中插6.
[18] 张宁，郑群，傅晓艳，等.人工光照对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017，26（5）：451-455.
[19] Azevedo MF，Horvath A，Bornstein ER，et al.Cyclic AMP and c-KIT signaling in familial testicular germ cell tumor predisposition[J]. J Clin Endocrinol Metab，2013，98（8）：E1393-1400.
[20] 陈云蕾，吴雨红，赵新霞，等.NYD-SP27基因对绵羊精子质量及精子中cAMP信号通路的影响[J].畜牧与兽医，2020，52（2）：18-22.
[21] 江峰，朱勇，陈颖，等.孕酮通过ABHD2受体介导的cAMP-PKA信号通路调控精子受精功能的研究[J].中国男科学杂志，2020，34（6）：12-16.
（收稿日期：2021-04-07）