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目的
利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术将293T细胞中的Ku80基因敲除，建立Ku80敲除的293T细胞株，并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。
方法首先，设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos，利用pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)质粒构建表达导向RNA(sgRNA)载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应(PCR)和T7E1内切酶酶切鉴定，确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选，挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤，以磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)为指标检测DNA损伤，同时用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。
结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞，用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后，对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为(30.67±2.49)%和(88.00±1.63)%(P＝0.000)，表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性，阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为(53.99±1.29)%和(32.42±1.20)%(P＝0.000)。
结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。