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摘要：尖吻蝮蛇类凝血酶直接裂解纤维蛋白原且不激活凝血因子表现出良好抗凝效应，是重要的血栓类药物。大肠杆菌中高效表达重组尖吻蝮蛇类凝血酶，通过阴离子层析（DEAE650M，0.02M PBS+0.2M NaCl洗脱）和亲和层析（镍柱，0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脱），获得较纯样品。利用肠激酶酶切、纤维蛋白凝结活性、免疫印迹方式鉴定纯化样品为活性目的蛋白。此结果为商品化生产、应用类凝血酶提供思路及方向。
关键词：类凝血酶 纯化 鉴定
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）07（b）-0000-00
类凝血酶（thrombin-like enzyme）是一种丝氨酸蛋白酶[1-2]，作用于纤维蛋白原，使其产生侧链不交联的片段。该片段易被网状内皮系统吞噬或正常纤溶作用清除[3-4]，而不激活凝血因子，具有重要医药价值。受限于天然活体来源及复杂的复杂纯化条件，蛇毒类凝血酶在血栓类药物研发中难以突破[5]。本文利用工程菌构建、表达出尖吻蝮蛇类凝血酶，研究其纯化条件，鉴定其纯化效果，以期大量、高效获得活性蛋白，应用于商品化生产、利用。
1 材料与方法
1.1菌株
稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）由福州大学生物工程研究所保存。
1.2试剂与仪器
离子交换树脂填料DEAE650M、亲和层析组氨酸填料（His镍柱）保藏于福州大学生物工程研究所；重组肠激酶（EK酶）购于invitrogen公司产品；牛纤维蛋白原购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。
蛋白纯化系统及恒压恒流电泳仪购于东方特力科贸中心；Mini PROTEIN II电泳槽购于美国BIO-RAD公司。
1.3重组类凝血酶表达
稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）于LB+培养基（LB培养基添加有氨苄青霉素），30℃，诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下培养3h[6]，获取重组蛋白.。
1.4重组类凝血酶纯化
1.4.1阴离子层析——DEAE650M
综合预实验结果，将重组菌破碎液通过阴离子层析柱（DEAE650M），通过添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS缓冲液）阶梯洗脱，收集峰样用紫外分光光度计测定OD280，并记录数据、绘制曲线图谱，以此获得初步纯化样品，-20℃保藏备用. 。
全过程中使用缓冲液如表1所示。
试剂 组成
平衡缓冲液 20mM PBS（pH7.5）
洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度NaCl）
1.4.2亲和层析——镍柱
利用重组融合蛋白表达标签（六个His残基序列）能够与二价金属离子（如镍、锌等）螯合，达到特异性吸附、分离功效。将阴离子层析收集含有目的蛋白样品，通过镍柱亲和层析再次纯化，全过程使用缓冲液如表2所示。样品经紫外分光光度计测定OD280，记录数据并绘制曲线图谱，收集纯化样品，-20℃保藏备用。
试剂 组成
镍柱活化缓冲液 0.1M NiSO4缓冲液
平衡缓冲液 20mM PBS（pH8.0）
洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度咪唑、0.5M NaCl）
1.5重组类凝血酶鉴定
1.5.1 SDS-PAGE
采用不连续凝胶检测，分离胶浓度12.5%，蛋白条带用考马斯亮蓝染色[7]。
1.5.2纤维蛋白凝结活性
1mg· mL-1的纯化产物与9mg·mL-1的牛纤维蛋白原（均溶解于Tris-HCl缓冲溶液，pH7.0，）37℃孵育1h，观察凝结现象。同时以纯水、牛纤维蛋白代替目标蛋白作对照组[8-9]。
1.5.3肠激酶酶切
pET32a载体在融合硫还原蛋白与自身蛋白间存在肠激酶酶切位点。取纯化样品100μl加入1U肠激酶，轻混后37℃温浴2h，利用肠激酶酶切特性，将融合蛋白酶分成两个片段，而后通过SDS-PAGE电泳对片段分子量测定，初步验证重组融合蛋白。实验以纯水代替肠激酶作为空白对照组。
1.5.4免疫印迹
纯化样品经SDS-PAGE电泳后割下相应凝胶，利用电转法将蛋白转移至PVDF膜（电泳-割胶-转膜）；而后转移至封闭液中，室温下振摇1h（免疫：封闭）；取出、吸净残液，将蛋白面浸没于一抗液，室温孵育1h，而后用TBST室温下振摇两次，每次10min，再用TBS室温下振摇10min（免疫：一抗反应）；取出、吸净残液，用二抗液室温孵育1-2h，而后再用TBST室温下振摇两次，每次10min，TBS室温下振摇10min，取出进行显色（免疫：二抗反应）.）。
2 结论
2.1重组类凝血酶纯化
2.1.1阴离子层析——DEAE650M
诱导表达后菌体经超声波破碎、高速离心，结果显示目的蛋白大部分存在于上清液（前期预实验已验证），为可溶性蛋白。根据蛋白质间理化性质差异，经不同盐溶液阶梯洗脱，检测OD280，收集峰样，绘制曲线，如图1所示。为判定收集样品中蛋白分布，经SDS-PAGE检验，如图2所示。
通过ExPASy-Compute pI/Mw计算可知，尖吻蝮蛇类凝血酶理论分子质量为44.3kDa，对比电泳图谱可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脱条件下得到主要目的蛋白样品（D2），收集此峰样用于再次纯化 。 2.1.2亲和层析——镍柱
粗纯化类凝血酶样品（D2）通过镍柱亲和层析，在不同咪唑浓度条件下阶梯洗脱，收集样品，检测OD280绘制曲线，如图3所示。获得峰样，通过SDS-PAGE检测，如图4所示。 电泳图谱中N2样品（0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脱）在目的蛋白理论分子量处存在较为单一条带，推断经过两步操作，可获得较纯尖吻蝮蛇类凝血酶样品。
2.2重组类凝血酶验证
2.2.1肠激酶酶切
表达蛋白样品与肠激酶在37℃条件下反应1h，利用SDS-PAGE检测，如图5所示。融合蛋白被剪切为分子量18kDa和26kDa两部分，且目的蛋白处存在明显因剪切而减少的痕迹，此现象与预期构建结果相契合。一定程度上表明，表达蛋白即尖吻蝮蛇类凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）。
2.2.2纤维蛋白凝结活性
利用试管法[8-9]处理样品，如图6所示 。阴性实验组（空白对照组，超纯水）样品呈现澄清透明状液体，阳性实验组（牛凝血酶）呈现明显浑浊胶状，样品组（纯化目标蛋白）呈现与阳性实验组相似浑浊胶状。
结果表明，重组蛋白pET32a-acutobin对牛纤维蛋白原具有特异酶活性，能使其出现白色浑浊状态，但无法真正形成凝固。其凝结效果与天然类凝血酶活性间仍存在差距。
2.2.3免疫印迹（Western blotting）
经过两步纯化后样品，借助His标签抗体进行免疫印迹反应，结果如图7所示。N2样品条带均是带有His标签的相关蛋白质，推断理论分子量处条带为类凝血酶pET32a-acutobin，其余条带可能为多个目的蛋白集合体（上端）和目的蛋白分离体（下端）.。
3 结语
综上实验结果表明，利用工程菌重组表达类凝血酶，经纯化应用于实际生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表达，以较低的环境代价为前提可获得大量用于医疗的血栓类药物，解决了直接由活体动物提取的道德问题、提取量少、纯化不易等瓶颈问题。通过简单的两步纯化，能够很好的排除杂质干扰，得到较为单一且具有活性的目的蛋白，既优化工艺又节省成本。然而，酶活力验证实验发现目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。然而，酶活力验证实验发现目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。
重组类凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）要正式推向市场，现阶段仍需解决酶活力提升[10]、保存问题，热源性、致敏性物质去除问题等 。同时，相较于原核体系大肠杆菌胞内表达的类凝血酶，可利用重组手段构建胞外分泌真核体系目的蛋白从纯化及适用性角度提升其整体价值。
参考文献
[1]Swenson S， Markland F S. Snake venom fibrin（ogen）olytic enzymes. Toxicon，2005，45：1021-1039.
[2] Serrano S M T， Maroun R C. Snake venom serine proteinases： sequence homology vs. substrate specificity， a paradox to be solved. Toxicon， 2005， 45：1115-1132.
[3]任予斌，张向东，刘海凤.降纤酶治疗视网膜动脉阻塞的临床研究.眼科新进展，2005，25（4）：356-357.
[4]黄如训，林健雯.急性缺血性脑血管病的降纤治疗.国外医学（脑血管疾病分册），2004，12（1）：3-6.
[5]李家祺，李谦，唐松山，等.蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展[J].药物生物技术，2013，20（2）：167-170.
[6]程欲，缪少锋，李仁宽，等.尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化[J].福州大学学报（自然科学版），2013，41（2）：252-256.
[7]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].第2版.北京：科学出版社，2005，92-118.
[8]袁盛凌，王芃，陶好霞.蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达.生物工程学报，2009， 25（4）：526-532.
[9]段涛，程波，王旻，等.蛇毒类凝血酶的纯化及鉴定.化学与生物工程，2006，23（7）：40-41.
[10]赵伟，曹宇虹，徐宏江 等.浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性[J].中国药科大学学报，2011，42（6）：565-569.
关键词：类凝血酶 纯化 鉴定
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）07（b）-0000-00
类凝血酶（thrombin-like enzyme）是一种丝氨酸蛋白酶[1-2]，作用于纤维蛋白原，使其产生侧链不交联的片段。该片段易被网状内皮系统吞噬或正常纤溶作用清除[3-4]，而不激活凝血因子，具有重要医药价值。受限于天然活体来源及复杂的复杂纯化条件，蛇毒类凝血酶在血栓类药物研发中难以突破[5]。本文利用工程菌构建、表达出尖吻蝮蛇类凝血酶，研究其纯化条件，鉴定其纯化效果，以期大量、高效获得活性蛋白，应用于商品化生产、利用。
1 材料与方法
1.1菌株
稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）由福州大学生物工程研究所保存。
1.2试剂与仪器
离子交换树脂填料DEAE650M、亲和层析组氨酸填料（His镍柱）保藏于福州大学生物工程研究所；重组肠激酶（EK酶）购于invitrogen公司产品；牛纤维蛋白原购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。
蛋白纯化系统及恒压恒流电泳仪购于东方特力科贸中心；Mini PROTEIN II电泳槽购于美国BIO-RAD公司。
1.3重组类凝血酶表达
稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株（Rosetta-pET32a-acutobin）于LB+培养基（LB培养基添加有氨苄青霉素），30℃，诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下培养3h[6]，获取重组蛋白.。
1.4重组类凝血酶纯化
1.4.1阴离子层析——DEAE650M
综合预实验结果，将重组菌破碎液通过阴离子层析柱（DEAE650M），通过添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（PBS缓冲液）阶梯洗脱，收集峰样用紫外分光光度计测定OD280，并记录数据、绘制曲线图谱，以此获得初步纯化样品，-20℃保藏备用. 。
全过程中使用缓冲液如表1所示。
试剂 组成
平衡缓冲液 20mM PBS（pH7.5）
洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度NaCl）
1.4.2亲和层析——镍柱
利用重组融合蛋白表达标签（六个His残基序列）能够与二价金属离子（如镍、锌等）螯合，达到特异性吸附、分离功效。将阴离子层析收集含有目的蛋白样品，通过镍柱亲和层析再次纯化，全过程使用缓冲液如表2所示。样品经紫外分光光度计测定OD280，记录数据并绘制曲线图谱，收集纯化样品，-20℃保藏备用。
试剂 组成
镍柱活化缓冲液 0.1M NiSO4缓冲液
平衡缓冲液 20mM PBS（pH8.0）
洗脱缓冲液 20mM PBS（含不同浓度咪唑、0.5M NaCl）
1.5重组类凝血酶鉴定
1.5.1 SDS-PAGE
采用不连续凝胶检测，分离胶浓度12.5%，蛋白条带用考马斯亮蓝染色[7]。
1.5.2纤维蛋白凝结活性
1mg· mL-1的纯化产物与9mg·mL-1的牛纤维蛋白原（均溶解于Tris-HCl缓冲溶液，pH7.0，）37℃孵育1h，观察凝结现象。同时以纯水、牛纤维蛋白代替目标蛋白作对照组[8-9]。
1.5.3肠激酶酶切
pET32a载体在融合硫还原蛋白与自身蛋白间存在肠激酶酶切位点。取纯化样品100μl加入1U肠激酶，轻混后37℃温浴2h，利用肠激酶酶切特性，将融合蛋白酶分成两个片段，而后通过SDS-PAGE电泳对片段分子量测定，初步验证重组融合蛋白。实验以纯水代替肠激酶作为空白对照组。
1.5.4免疫印迹
纯化样品经SDS-PAGE电泳后割下相应凝胶，利用电转法将蛋白转移至PVDF膜（电泳-割胶-转膜）；而后转移至封闭液中，室温下振摇1h（免疫：封闭）；取出、吸净残液，将蛋白面浸没于一抗液，室温孵育1h，而后用TBST室温下振摇两次，每次10min，再用TBS室温下振摇10min（免疫：一抗反应）；取出、吸净残液，用二抗液室温孵育1-2h，而后再用TBST室温下振摇两次，每次10min，TBS室温下振摇10min，取出进行显色（免疫：二抗反应）.）。
2 结论
2.1重组类凝血酶纯化
2.1.1阴离子层析——DEAE650M
诱导表达后菌体经超声波破碎、高速离心，结果显示目的蛋白大部分存在于上清液（前期预实验已验证），为可溶性蛋白。根据蛋白质间理化性质差异，经不同盐溶液阶梯洗脱，检测OD280，收集峰样，绘制曲线，如图1所示。为判定收集样品中蛋白分布，经SDS-PAGE检验，如图2所示。
通过ExPASy-Compute pI/Mw计算可知，尖吻蝮蛇类凝血酶理论分子质量为44.3kDa，对比电泳图谱可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脱条件下得到主要目的蛋白样品（D2），收集此峰样用于再次纯化 。 2.1.2亲和层析——镍柱
粗纯化类凝血酶样品（D2）通过镍柱亲和层析，在不同咪唑浓度条件下阶梯洗脱，收集样品，检测OD280绘制曲线，如图3所示。获得峰样，通过SDS-PAGE检测，如图4所示。 电泳图谱中N2样品（0.02M PBS+0.5M NaCl溶液+20mM咪唑溶液洗脱）在目的蛋白理论分子量处存在较为单一条带，推断经过两步操作，可获得较纯尖吻蝮蛇类凝血酶样品。
2.2重组类凝血酶验证
2.2.1肠激酶酶切
表达蛋白样品与肠激酶在37℃条件下反应1h，利用SDS-PAGE检测，如图5所示。融合蛋白被剪切为分子量18kDa和26kDa两部分，且目的蛋白处存在明显因剪切而减少的痕迹，此现象与预期构建结果相契合。一定程度上表明，表达蛋白即尖吻蝮蛇类凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）。
2.2.2纤维蛋白凝结活性
利用试管法[8-9]处理样品，如图6所示 。阴性实验组（空白对照组，超纯水）样品呈现澄清透明状液体，阳性实验组（牛凝血酶）呈现明显浑浊胶状，样品组（纯化目标蛋白）呈现与阳性实验组相似浑浊胶状。
结果表明，重组蛋白pET32a-acutobin对牛纤维蛋白原具有特异酶活性，能使其出现白色浑浊状态，但无法真正形成凝固。其凝结效果与天然类凝血酶活性间仍存在差距。
2.2.3免疫印迹（Western blotting）
经过两步纯化后样品，借助His标签抗体进行免疫印迹反应，结果如图7所示。N2样品条带均是带有His标签的相关蛋白质，推断理论分子量处条带为类凝血酶pET32a-acutobin，其余条带可能为多个目的蛋白集合体（上端）和目的蛋白分离体（下端）.。
3 结语
综上实验结果表明，利用工程菌重组表达类凝血酶，经纯化应用于实际生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表达，以较低的环境代价为前提可获得大量用于医疗的血栓类药物，解决了直接由活体动物提取的道德问题、提取量少、纯化不易等瓶颈问题。通过简单的两步纯化，能够很好的排除杂质干扰，得到较为单一且具有活性的目的蛋白，既优化工艺又节省成本。然而，酶活力验证实验发现目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。然而，酶活力验证实验发现目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。
重组类凝血酶（Rosetta-pET32-acutobin）要正式推向市场，现阶段仍需解决酶活力提升[10]、保存问题，热源性、致敏性物质去除问题等 。同时，相较于原核体系大肠杆菌胞内表达的类凝血酶，可利用重组手段构建胞外分泌真核体系目的蛋白从纯化及适用性角度提升其整体价值。
参考文献
[1]Swenson S， Markland F S. Snake venom fibrin（ogen）olytic enzymes. Toxicon，2005，45：1021-1039.
[2] Serrano S M T， Maroun R C. Snake venom serine proteinases： sequence homology vs. substrate specificity， a paradox to be solved. Toxicon， 2005， 45：1115-1132.
[3]任予斌，张向东，刘海凤.降纤酶治疗视网膜动脉阻塞的临床研究.眼科新进展，2005，25（4）：356-357.
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[5]李家祺，李谦，唐松山，等.蛇毒类凝血酶基因工程的研究进展[J].药物生物技术，2013，20（2）：167-170.
[6]程欲，缪少锋，李仁宽，等.尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化[J].福州大学学报（自然科学版），2013，41（2）：252-256.
[7]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].第2版.北京：科学出版社，2005，92-118.
[8]袁盛凌，王芃，陶好霞.蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达.生物工程学报，2009， 25（4）：526-532.
[9]段涛，程波，王旻，等.蛇毒类凝血酶的纯化及鉴定.化学与生物工程，2006，23（7）：40-41.
[10]赵伟，曹宇虹，徐宏江 等.浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性[J].中国药科大学学报，2011，42（6）：565-569.