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摘要：【目的】分析蓝果忍冬果实花青素含量及其合成相关调控基因表达情况，为蓝果忍冬种质的挖掘、利用及花青素的合成调控研究提供参考依据。【方法】利用高效液相色谱检测技术定性定量分析不同蓝果忍冬品种（蓓蕾、HSY-4和日本-5）果实花青素成分及含量，并以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对3个品种不同成熟期花青素合成相关基因及转录因子的表达量进行分析。【结果】在525 nm波长下，从成熟蓝果忍冬果实中检测出8种花青素，含量最高的花青素是矢车菊3-葡萄糖，占总花青素含量的76.61%～86.67%，其中蓓蕾的花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW，日本-5最低，为162.79 mg/100 gFW。半转色期花青素合成相关基因表达量最高，与花青素积累情况相符；PAL、ANS和bHLH基因的表达量随花青素合成积累量增加呈先升高后降低的变化趋势。【结论】蓝果忍冬果实含8种花青素，以矢车菊为苷元的花青素种类最多，其合成相关基因中PAL、ANS和bHLH基因在花青素合成过程中起调控作用。蓓蕾、HSY-4和日本-5的花青素合成相关基因表达情况相似，但品种间存在差异。
关键词： 蓝果忍冬；花青素；含量；基因表达
中图分类号： S663.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）07-1139-09
0 引言
【研究意义】蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）又名蓝靛果，属忍冬科忍冬属蓝果亚组灌木类浆果，其变种在我国分布广泛（中国植物志编辑委员会，1988），其果实富含花青素、氨基酸、儿茶酸和槲皮苷等生理活性物质（李淑芹等，1994；赵佳，2010），具有很高的营养保健价值。蓝果忍冬是目前发现花青素含量最高的水果之一（Chaovanalikit et al.，2004），高于蓝莓、树莓、黑莓和紅加仑等浆果（Celli et al.，2014），且花青素种类丰富，其中含量最高的是矢车菊3-葡萄糖苷，占总含量的84%～92%（Kusznierewicz et al.，2012），但有关蓝果忍冬果实花青素的生物合成及其基因调控机理尚不清楚。因此，对蓝果忍冬花青素合成及其基因调控表达开展研究，有助于了解蓝果忍冬花青素合成过程及影响因素，为进一步挖掘利用其种质资源提供理论依据。【前人研究进展】花青素是植物体内一类重要的次生代谢物质，属于类黄酮化合物，不仅是天然着色剂，还是最有效的天然抗氧化剂（Wang and Stoner，2008；刘奕琳，2012；唐容等，2017），在抑制脂质过氧化、清除自由基等方面发挥重要作用，已广泛应用于化妆品和食品添加剂研发领域（王海竹等，2016；乌日罕等，2016）。花青素是类黄酮代谢途径中一个分支产物，由苯丙氨酸经3个阶段的反应合成，合成路径涉及三类调控基因及15个结构基因（胡可等，2009）。目前，相关调控基因及转录因子已有报道。Laurent等（2006）研究发现，葡萄R2R3-MYB型转录因子VvMYB5a主要在果皮、果肉和种子的发育早期表达，而VvMYBAl基因在浆果皮中特异表达，可诱导葡萄皮花青素的生物合成，VvMYBAl基因的激活作用需要bHLH蛋白协助；贾赵东等（2014）从花生、马鞭草、紫苏等植物中克隆出结构基因UFGT，并证实苹果、草莓、荔枝和梨中花青苷的积累与UFGT基因表达呈明显的正相关，在不同品种中UFGT基因的表达量也不同。【本研究切入点】目前关于蓝果忍冬果实花青素生物合成及其相关基因表达调控的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对蓝果忍冬果实花青素的种类、含量、合成相关基因及其转录调控因子的表达进行研究，为蓝果忍冬种质挖掘、利用及花青素合成调控研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试蓝果忍冬品种（系）为蓓蕾[（subsp. altaica×subsp. Kamtschatica）×subsp. Kamtschatica]、HSY-4（L. caerulea L. subsp. venulosa）和日本-5（L. caerulea L. subsp. emphyllocalyx），种植于东北农业大学蓝果忍冬种质资源圃，于2014年4月22日进入盛花期，选取各品种（系）生长健壮的植株进行标记，于2014年5月25日果实绿熟期（花后33 d）及6月4日完熟期（花后43 d）分别采收果实作为花青素种类和含量定性定量分析材料。采收蓓蕾不同发育期的果实（幼果期5月16日、绿熟期5月25日、半转色期5月28日、完熟期6月4日和软化期6月15日）作为果实花青素合成分析材料（图1），用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测分析。5月25日采收蓓蕾和HSY-4绿熟期果实、6月1日采收日本-5绿熟期果实，6月4日采收蓓蕾和HSY-4完熟期果实，6月13日采收日本-5完熟期果实（图2），用于品种间花青素合成相关基因的表达分析。上述材料被采摘后立即用液氮速冻处理并于-80 ℃冰箱保存。
1. 2 花青素种类和含量分析
参考Wang等（2014）的方法，利用安捷伦液质联用系统（Agilent 1100 LC/MSD Trap VL，美国）检测花青素种类及含量，流动相A为含1%甲酸的双蒸水，流动相B为含15%甲醇的乙腈。洗脱条件：0 min 5% B，30 min 30% B，35 min 5% B，每个样品设3个重复；紫外检测器（Agilent G1314B）检测波长为525 nm；以矢车菊3-葡萄糖和矢车菊3-芸香糖苷为标准品绘制标准曲线，含量由峰面积计算方法得出，单位为mg/100 gFW。
1. 3 花青素合成相关基因表达分析
1. 3. 1 引物设计及合成 根据花青素合成的代谢通路，选取合成相关的结构基因PAL、CHS、F3H、DFR、ANS及转录因子MYB、bHLH、WD40，并以β-Actin为内参基因。利用Primer 6.0设计花青素合成相关基因和β-Actin的引物，如表1所示。 1. 3. 2 RNA提取及cDNA合成 利用RN38-EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒[艾德莱（北京）有限公司]提取幼果期、绿熟期、半转色期、完熟期和软化期果实的RNA，并用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成cDNA。反应体系如表2所示。为提高合成效率，将RNA模板、引物与RNase-free Water混匀后，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，然后再加入其他组分，42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 min，使TransScript RT和gDNA Remover失活。
1. 3. 3 qRT-PCR检测 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），荧光染料为SYBR Green I。反应体系（20.0 μL）：模板2.0 μL，正向引物（10 μmol/L）1.0 μL，反向引物（10 μmol/L）1.0 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；68 ℃ 1 min。每个样品设4个重复。采用2-△△Ct法分析检测结果（张丽等，2015）。
1. 4 统计分析
试验数据采用Excel 2013进行统计和制图，采用SPSS 21.0进行相关性分析。
2 结果与分析
2. 1 花青素种类鉴定结果
在紫外检测器下，花青素在260～280 nm和490～ 550 nm出现最大吸收峰（刘海英等，2012）。从图3可看出，利用高效液相色谱仪和紫外检测器在525 nm波长下对成熟蓝果忍冬果实进行扫描检测，发现8种花青素（A1～A8），出峰时间为11.77～23.82 min。峰值高低代表花青素含量的高低，A3为蓝果忍冬果实含量最高的花青素，吸收峰分别为280.8和516.6 nm。
从8种花青素（A1～A8）的质譜信息（表3）可看出，主要有3种苷元离子存在于蓝果忍冬果实花青素中，分别为矢车菊色素（Cyanidin，m/z 287），天竺葵色素（Pelargonidin，m/z 271）和芍药色素（Peonidin，m/z 301）。通过与标准品保留时间进行比较（16.07和17.15 min），A3和A4被鉴定为矢车菊3-葡萄糖（Cyanidin 3-glucoside）和矢车菊3-芸香糖（Cyanidin 3-rutinoside）。表明花青素的糖基化常发生在B环的3和5位，尤其易发生在3位。已有研究证实，花青素的洗脱时间为飞燕草色素（Delphinidin，Dp）>矢车菊色素（Cyanidin，Cy）>牵牛花色素（Petunidin，Pt）>天竺葵色素（Pelargonidin，Pg）>芍药色素（Peonidin，Pn）>锦葵色素（Malvidin，Mv）（Singleton et al.， 1999； Mortazavi et al.， 2008； Abad-García et al.，2009；Grabherr et al.，2011）。A1显示了非常高的碎片离子m/z 449（[Cy+162]+）及分子离子m/z 611（[Cy+162+162]+），由此判断，A1为矢车菊3，5-二葡萄糖（Cyanidin 3，5-diglucoside）；A2为矢车菊—葡萄糖醛酸（Cyanidin derivatives），其存在m/z 463（[Cy+176]+）和625（[Cy+176+162]+）两种离子片段，但仍需进一步确定；A5存在高丰度的m/z 271和433（[Pg+162]）+离子碎片峰，被判断为天竺葵3-葡萄糖（Pelargonidin 3-glucoside）；A6和A7均存在m/z 301离子片段，为芍药色素苷元，A6含有m/z 463（[Pn+162]）+片段，而A7含有m/z 609（[Pn+308]）+片段，故两种化合物分别判定为芍药3-葡萄糖（Peonidin 3-glucoside）和芍药3-芸香糖（Peonidin 3-rutinoside）；A8含有碎片离子峰m/z 287和491，可能为矢车菊六碳糖衍生物[Cyanidin-（acetoyl）-
hexoside]，因为花青素苷元的极性越小，保留时间越长（Iseli et al.，1999；Chaovanalikit et al.，2004；Wang and Stoner，2008；Wojdy？覥o et al.，2013）。综上所述，8种花青素中以矢车菊为苷元的花青素种类最多（5种），表明蓝果忍冬果实中花青素主要以矢车菊色素为主。
高效液相色谱检测结果还显示，不同品种的蓝果忍冬果实花青素种类有所差异，日本-5仅检测到除矢车菊六碳糖衍生物以外的7种花青素，蓓蕾和HSY-4均检测到8种花青素（表4）。
2. 2 花青素含量测定结果
由表4可知，3个品种果实中花青素含量最高的均为矢车菊3-葡萄糖（A3），占总花青素含量的76.61%～
86.67%。从花青素总含量来看，不同品种间差异明显，蓓蕾成熟果实中总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW，日本-5含量最低，为162.79 mg/100 gFW。
2. 3 花青素合成相关基因的表达分析结果
不同生长发育期的蓓蕾蓝果忍冬果实qRT-PCR检测结果如图4、图5和图6所示，花青素合成相关的结构基因和转录因子在不同时期表达量均不同，其表达量随着果实的成熟均呈先升高后降低的变化趋势，总花青素含量呈升高趋势。随果实花青素的积累（图6），果皮颜色发生转变，花青素合成相关的基因表达量增加，至半转色期时表达量达峰值，此时花青素合成并大量积累，至软化期总花青素含量达500.14 mg/100 gFW。随果实颜色的加深至果实软化，花青素不断的积累，而此时基因表达量逐渐降低。 5个结构基因在不同时期的表达量也不相同（图4）。二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、查尔酮合酶（CHS）基因变化不明显，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）和花青素合成酶（ANS）基因在花青素合成积累过程中相对表达量增幅较大，说明此时期苯丙氨酸作为大量花青素合成的直接前体物质参与到此途径中，PAL和ANS在花青素合成途径中发挥重要作用。3个转录因子在不同时期的表达量差异也较明显（图5），随着果实颜色加深，bHLH（TT8）基因表达量升高，果实进入软化阶段，表达量又下降，说明bHLH基因在调控花青素合成方面发挥重要作用。MYB和WD40基因表达量变化不明显，可能与MYB家族和WD40家族基因参与多个代谢过程有关。
2. 4 不同品种蓝果忍冬间花青素合成相关基因表达对比分析结果
不同品种蓝果忍冬果实总花青素含量比较结果见图7，3种品种果实在完熟期花青素含量大量积累，其中蓓蕾总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW，其次为HSY-4，总花青素含量达348.60 mg/100 gFW，最低的为日本-5，总花青素含量为162.79 mg/100 gFW。
5个结构基因和3个转录因子qRT-PCR检测结果如图8和图9所示，无论结构基因还是转录因子，3个品种蓝果忍冬果实完熟期花青素合成相关基因的相对表达水平均高于绿熟期。5个结构基因中，PAL和ANS基因的相对表达水平最高，说明在整个花青素合成积累过程中这2个结构基因高效表达，对花青素的合成起重要作用；3个转录因子中，bHLH基因的表达水平最高，而MYB和WD40基因表达水平较低，说明bHLH基因在蓝果忍冬果实花青素合成过程中可能起到关键作用。比较3个品种的果实完熟期发现，蓓蕾果实中ANS和bHLH基因表达量最高，在HSY-4果实中PAL基因的表达量最高，而在日本-5果实中5个结构基因的表达量均比蓓蕾和HSY-4果实低，此结果与蓓蕾果实中总花青素的积累最高而日本-5中积累量最少相符；而在3个品种的果实绿熟期，HSY-4果实中的bHLH基因表达量最高，品种间存在差异。
3 讨论
本研究发现蓝果忍冬含8种花青素成分，其中含量最高的花青素为矢车菊3-葡萄糖，其含量占总花青素含量的76.61%～86.67%。盡管矢车菊3-葡萄糖普遍存在于水果中，但在蓝果忍冬果实中的含量明显高于其他浆果，如黑莓（105.65 mg/100 gFW）和蓝莓（77.50 mg/100 gFW）（Chen et al.，2014），因此蓝果忍冬可作为矢车菊3-葡萄糖的优秀提取材料。本研究中蓓蕾果实中总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW。黑加仑和红树莓果实中总花青素含量分别为250.00和323.50 mg/100 gFW（León-González et al.，2015），明显低于蓝果忍冬果实中总花青素含量，表明蓝果忍冬是花青素提取及保健食品加工的优质资源。
花青素的合成除了受合成基因的调控外，环境因子对其影响也较大，基因表达是在特定环境等信号刺激下的选择性表达结果（马廷蕊等，2012）。本研究中3个品种的蓝果忍冬引种自不同地方，其中日本-5引种自日本库页岛地区，HSY-4引种自俄罗斯海参崴地区，蓓蕾为堪察加忍冬和阿尔泰忍冬杂交的F1代再与勘察加忍冬回交的F2代选育获得的优系品种（王艺菲，2014），三者属于不同的亚种，因此花青素生物合成过程可能受遗传因素影响较大，导致品种间的花青素合成机制存在差异（黄鸿曼等，2011）。但在蓝果忍冬果实整个生长过程中，绿熟期后果实内开始合成色素且大量积累，此时花青素合成相关基因大量表达，表达情况与花青素合成情况基本一致。虽然3个品种间花青素合成过程中基因表达略有差异，但整体来看，各基因相对表达模式相似，从一定的水平上可解释蓝果忍冬果实花青素合成的过程。
在基因转录调控过程中，多数情况下一条以上的基因编码同一个酶（Li et al.，2012）。本研究发现，MYB和WD40基因在整个果实发育期表达水平均不高，可能是其在蓝果忍冬果实中特异性不强，也可能是植株间有遗传差异性或果实的空间分布对环境信号的敏感度不同。张华磊等（2009）研究证实，调控苹果果皮花青苷生物合成的MdMYB1基因转录丰度受光照强烈诱导。据此推测，果实表面的光照分布是影响MYB和WD40基因表达水平不明显的因素之一。此外，在拟南芥长角果中TT8（bHLH）基因能调节DFR基因的表达，且依赖于TTG1（WD40蛋白）和TT2（R2R3-MYB蛋白）（Takos et al.，2006；胡可等，2010；杨鹏程等，2012），但在本研究的蓝果忍冬果实中，bHLH基因在半转色期高度表达，说明此基因在花青素合成及积累过程中发挥重要作用，且DFR基因表达不明显，DFR基因表达水平呈低水平状态。在苹果果实中，bHLH基因可激活CHS、DFR和ANS等结构基因的表达，从而促进花青素的合成与积累（冯晓明，2011）；在拟南芥中，TT8（bHLH）与CHS、CHI、F3H和DFR基因可直接相互作用（Burbulis and Winkel-Shirley，1999；Baudry et al.，2004）。本研究也发现PAL、CHS和ANS基因的表达水平与bHLH基因一致，由此猜测，bHLH基因可能是通过激活PAL、CHS和ANS等结构基因来调控花青素的生物合成过程，但其作用机制有待进一步研究。
4 结论
蓝果忍冬含8种花青素，以矢车菊为苷元的花青素种类最多，其PAL、ANS和bHLH基因在花青素合成过程中起调控作用。蓓蕾、HSY-4和日本-5的花青素合成相关基因表达情况相似，但品种间存在差异。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 蓝果忍冬；花青素；含量；基因表达
中图分类号： S663.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）07-1139-09
0 引言
【研究意义】蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）又名蓝靛果，属忍冬科忍冬属蓝果亚组灌木类浆果，其变种在我国分布广泛（中国植物志编辑委员会，1988），其果实富含花青素、氨基酸、儿茶酸和槲皮苷等生理活性物质（李淑芹等，1994；赵佳，2010），具有很高的营养保健价值。蓝果忍冬是目前发现花青素含量最高的水果之一（Chaovanalikit et al.，2004），高于蓝莓、树莓、黑莓和紅加仑等浆果（Celli et al.，2014），且花青素种类丰富，其中含量最高的是矢车菊3-葡萄糖苷，占总含量的84%～92%（Kusznierewicz et al.，2012），但有关蓝果忍冬果实花青素的生物合成及其基因调控机理尚不清楚。因此，对蓝果忍冬花青素合成及其基因调控表达开展研究，有助于了解蓝果忍冬花青素合成过程及影响因素，为进一步挖掘利用其种质资源提供理论依据。【前人研究进展】花青素是植物体内一类重要的次生代谢物质，属于类黄酮化合物，不仅是天然着色剂，还是最有效的天然抗氧化剂（Wang and Stoner，2008；刘奕琳，2012；唐容等，2017），在抑制脂质过氧化、清除自由基等方面发挥重要作用，已广泛应用于化妆品和食品添加剂研发领域（王海竹等，2016；乌日罕等，2016）。花青素是类黄酮代谢途径中一个分支产物，由苯丙氨酸经3个阶段的反应合成，合成路径涉及三类调控基因及15个结构基因（胡可等，2009）。目前，相关调控基因及转录因子已有报道。Laurent等（2006）研究发现，葡萄R2R3-MYB型转录因子VvMYB5a主要在果皮、果肉和种子的发育早期表达，而VvMYBAl基因在浆果皮中特异表达，可诱导葡萄皮花青素的生物合成，VvMYBAl基因的激活作用需要bHLH蛋白协助；贾赵东等（2014）从花生、马鞭草、紫苏等植物中克隆出结构基因UFGT，并证实苹果、草莓、荔枝和梨中花青苷的积累与UFGT基因表达呈明显的正相关，在不同品种中UFGT基因的表达量也不同。【本研究切入点】目前关于蓝果忍冬果实花青素生物合成及其相关基因表达调控的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对蓝果忍冬果实花青素的种类、含量、合成相关基因及其转录调控因子的表达进行研究，为蓝果忍冬种质挖掘、利用及花青素合成调控研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试蓝果忍冬品种（系）为蓓蕾[（subsp. altaica×subsp. Kamtschatica）×subsp. Kamtschatica]、HSY-4（L. caerulea L. subsp. venulosa）和日本-5（L. caerulea L. subsp. emphyllocalyx），种植于东北农业大学蓝果忍冬种质资源圃，于2014年4月22日进入盛花期，选取各品种（系）生长健壮的植株进行标记，于2014年5月25日果实绿熟期（花后33 d）及6月4日完熟期（花后43 d）分别采收果实作为花青素种类和含量定性定量分析材料。采收蓓蕾不同发育期的果实（幼果期5月16日、绿熟期5月25日、半转色期5月28日、完熟期6月4日和软化期6月15日）作为果实花青素合成分析材料（图1），用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测分析。5月25日采收蓓蕾和HSY-4绿熟期果实、6月1日采收日本-5绿熟期果实，6月4日采收蓓蕾和HSY-4完熟期果实，6月13日采收日本-5完熟期果实（图2），用于品种间花青素合成相关基因的表达分析。上述材料被采摘后立即用液氮速冻处理并于-80 ℃冰箱保存。
1. 2 花青素种类和含量分析
参考Wang等（2014）的方法，利用安捷伦液质联用系统（Agilent 1100 LC/MSD Trap VL，美国）检测花青素种类及含量，流动相A为含1%甲酸的双蒸水，流动相B为含15%甲醇的乙腈。洗脱条件：0 min 5% B，30 min 30% B，35 min 5% B，每个样品设3个重复；紫外检测器（Agilent G1314B）检测波长为525 nm；以矢车菊3-葡萄糖和矢车菊3-芸香糖苷为标准品绘制标准曲线，含量由峰面积计算方法得出，单位为mg/100 gFW。
1. 3 花青素合成相关基因表达分析
1. 3. 1 引物设计及合成 根据花青素合成的代谢通路，选取合成相关的结构基因PAL、CHS、F3H、DFR、ANS及转录因子MYB、bHLH、WD40，并以β-Actin为内参基因。利用Primer 6.0设计花青素合成相关基因和β-Actin的引物，如表1所示。 1. 3. 2 RNA提取及cDNA合成 利用RN38-EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒[艾德莱（北京）有限公司]提取幼果期、绿熟期、半转色期、完熟期和软化期果实的RNA，并用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成cDNA。反应体系如表2所示。为提高合成效率，将RNA模板、引物与RNase-free Water混匀后，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，然后再加入其他组分，42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 min，使TransScript RT和gDNA Remover失活。
1. 3. 3 qRT-PCR检测 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），荧光染料为SYBR Green I。反应体系（20.0 μL）：模板2.0 μL，正向引物（10 μmol/L）1.0 μL，反向引物（10 μmol/L）1.0 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；68 ℃ 1 min。每个样品设4个重复。采用2-△△Ct法分析检测结果（张丽等，2015）。
1. 4 统计分析
试验数据采用Excel 2013进行统计和制图，采用SPSS 21.0进行相关性分析。
2 结果与分析
2. 1 花青素种类鉴定结果
在紫外检测器下，花青素在260～280 nm和490～ 550 nm出现最大吸收峰（刘海英等，2012）。从图3可看出，利用高效液相色谱仪和紫外检测器在525 nm波长下对成熟蓝果忍冬果实进行扫描检测，发现8种花青素（A1～A8），出峰时间为11.77～23.82 min。峰值高低代表花青素含量的高低，A3为蓝果忍冬果实含量最高的花青素，吸收峰分别为280.8和516.6 nm。
从8种花青素（A1～A8）的质譜信息（表3）可看出，主要有3种苷元离子存在于蓝果忍冬果实花青素中，分别为矢车菊色素（Cyanidin，m/z 287），天竺葵色素（Pelargonidin，m/z 271）和芍药色素（Peonidin，m/z 301）。通过与标准品保留时间进行比较（16.07和17.15 min），A3和A4被鉴定为矢车菊3-葡萄糖（Cyanidin 3-glucoside）和矢车菊3-芸香糖（Cyanidin 3-rutinoside）。表明花青素的糖基化常发生在B环的3和5位，尤其易发生在3位。已有研究证实，花青素的洗脱时间为飞燕草色素（Delphinidin，Dp）>矢车菊色素（Cyanidin，Cy）>牵牛花色素（Petunidin，Pt）>天竺葵色素（Pelargonidin，Pg）>芍药色素（Peonidin，Pn）>锦葵色素（Malvidin，Mv）（Singleton et al.， 1999； Mortazavi et al.， 2008； Abad-García et al.，2009；Grabherr et al.，2011）。A1显示了非常高的碎片离子m/z 449（[Cy+162]+）及分子离子m/z 611（[Cy+162+162]+），由此判断，A1为矢车菊3，5-二葡萄糖（Cyanidin 3，5-diglucoside）；A2为矢车菊—葡萄糖醛酸（Cyanidin derivatives），其存在m/z 463（[Cy+176]+）和625（[Cy+176+162]+）两种离子片段，但仍需进一步确定；A5存在高丰度的m/z 271和433（[Pg+162]）+离子碎片峰，被判断为天竺葵3-葡萄糖（Pelargonidin 3-glucoside）；A6和A7均存在m/z 301离子片段，为芍药色素苷元，A6含有m/z 463（[Pn+162]）+片段，而A7含有m/z 609（[Pn+308]）+片段，故两种化合物分别判定为芍药3-葡萄糖（Peonidin 3-glucoside）和芍药3-芸香糖（Peonidin 3-rutinoside）；A8含有碎片离子峰m/z 287和491，可能为矢车菊六碳糖衍生物[Cyanidin-（acetoyl）-
hexoside]，因为花青素苷元的极性越小，保留时间越长（Iseli et al.，1999；Chaovanalikit et al.，2004；Wang and Stoner，2008；Wojdy？覥o et al.，2013）。综上所述，8种花青素中以矢车菊为苷元的花青素种类最多（5种），表明蓝果忍冬果实中花青素主要以矢车菊色素为主。
高效液相色谱检测结果还显示，不同品种的蓝果忍冬果实花青素种类有所差异，日本-5仅检测到除矢车菊六碳糖衍生物以外的7种花青素，蓓蕾和HSY-4均检测到8种花青素（表4）。
2. 2 花青素含量测定结果
由表4可知，3个品种果实中花青素含量最高的均为矢车菊3-葡萄糖（A3），占总花青素含量的76.61%～
86.67%。从花青素总含量来看，不同品种间差异明显，蓓蕾成熟果实中总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW，日本-5含量最低，为162.79 mg/100 gFW。
2. 3 花青素合成相关基因的表达分析结果
不同生长发育期的蓓蕾蓝果忍冬果实qRT-PCR检测结果如图4、图5和图6所示，花青素合成相关的结构基因和转录因子在不同时期表达量均不同，其表达量随着果实的成熟均呈先升高后降低的变化趋势，总花青素含量呈升高趋势。随果实花青素的积累（图6），果皮颜色发生转变，花青素合成相关的基因表达量增加，至半转色期时表达量达峰值，此时花青素合成并大量积累，至软化期总花青素含量达500.14 mg/100 gFW。随果实颜色的加深至果实软化，花青素不断的积累，而此时基因表达量逐渐降低。 5个结构基因在不同时期的表达量也不相同（图4）。二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、查尔酮合酶（CHS）基因变化不明显，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）和花青素合成酶（ANS）基因在花青素合成积累过程中相对表达量增幅较大，说明此时期苯丙氨酸作为大量花青素合成的直接前体物质参与到此途径中，PAL和ANS在花青素合成途径中发挥重要作用。3个转录因子在不同时期的表达量差异也较明显（图5），随着果实颜色加深，bHLH（TT8）基因表达量升高，果实进入软化阶段，表达量又下降，说明bHLH基因在调控花青素合成方面发挥重要作用。MYB和WD40基因表达量变化不明显，可能与MYB家族和WD40家族基因参与多个代谢过程有关。
2. 4 不同品种蓝果忍冬间花青素合成相关基因表达对比分析结果
不同品种蓝果忍冬果实总花青素含量比较结果见图7，3种品种果实在完熟期花青素含量大量积累，其中蓓蕾总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW，其次为HSY-4，总花青素含量达348.60 mg/100 gFW，最低的为日本-5，总花青素含量为162.79 mg/100 gFW。
5个结构基因和3个转录因子qRT-PCR检测结果如图8和图9所示，无论结构基因还是转录因子，3个品种蓝果忍冬果实完熟期花青素合成相关基因的相对表达水平均高于绿熟期。5个结构基因中，PAL和ANS基因的相对表达水平最高，说明在整个花青素合成积累过程中这2个结构基因高效表达，对花青素的合成起重要作用；3个转录因子中，bHLH基因的表达水平最高，而MYB和WD40基因表达水平较低，说明bHLH基因在蓝果忍冬果实花青素合成过程中可能起到关键作用。比较3个品种的果实完熟期发现，蓓蕾果实中ANS和bHLH基因表达量最高，在HSY-4果实中PAL基因的表达量最高，而在日本-5果实中5个结构基因的表达量均比蓓蕾和HSY-4果实低，此结果与蓓蕾果实中总花青素的积累最高而日本-5中积累量最少相符；而在3个品种的果实绿熟期，HSY-4果实中的bHLH基因表达量最高，品种间存在差异。
3 讨论
本研究发现蓝果忍冬含8种花青素成分，其中含量最高的花青素为矢车菊3-葡萄糖，其含量占总花青素含量的76.61%～86.67%。盡管矢车菊3-葡萄糖普遍存在于水果中，但在蓝果忍冬果实中的含量明显高于其他浆果，如黑莓（105.65 mg/100 gFW）和蓝莓（77.50 mg/100 gFW）（Chen et al.，2014），因此蓝果忍冬可作为矢车菊3-葡萄糖的优秀提取材料。本研究中蓓蕾果实中总花青素含量最高，达500.14 mg/100 gFW。黑加仑和红树莓果实中总花青素含量分别为250.00和323.50 mg/100 gFW（León-González et al.，2015），明显低于蓝果忍冬果实中总花青素含量，表明蓝果忍冬是花青素提取及保健食品加工的优质资源。
花青素的合成除了受合成基因的调控外，环境因子对其影响也较大，基因表达是在特定环境等信号刺激下的选择性表达结果（马廷蕊等，2012）。本研究中3个品种的蓝果忍冬引种自不同地方，其中日本-5引种自日本库页岛地区，HSY-4引种自俄罗斯海参崴地区，蓓蕾为堪察加忍冬和阿尔泰忍冬杂交的F1代再与勘察加忍冬回交的F2代选育获得的优系品种（王艺菲，2014），三者属于不同的亚种，因此花青素生物合成过程可能受遗传因素影响较大，导致品种间的花青素合成机制存在差异（黄鸿曼等，2011）。但在蓝果忍冬果实整个生长过程中，绿熟期后果实内开始合成色素且大量积累，此时花青素合成相关基因大量表达，表达情况与花青素合成情况基本一致。虽然3个品种间花青素合成过程中基因表达略有差异，但整体来看，各基因相对表达模式相似，从一定的水平上可解释蓝果忍冬果实花青素合成的过程。
在基因转录调控过程中，多数情况下一条以上的基因编码同一个酶（Li et al.，2012）。本研究发现，MYB和WD40基因在整个果实发育期表达水平均不高，可能是其在蓝果忍冬果实中特异性不强，也可能是植株间有遗传差异性或果实的空间分布对环境信号的敏感度不同。张华磊等（2009）研究证实，调控苹果果皮花青苷生物合成的MdMYB1基因转录丰度受光照强烈诱导。据此推测，果实表面的光照分布是影响MYB和WD40基因表达水平不明显的因素之一。此外，在拟南芥长角果中TT8（bHLH）基因能调节DFR基因的表达，且依赖于TTG1（WD40蛋白）和TT2（R2R3-MYB蛋白）（Takos et al.，2006；胡可等，2010；杨鹏程等，2012），但在本研究的蓝果忍冬果实中，bHLH基因在半转色期高度表达，说明此基因在花青素合成及积累过程中发挥重要作用，且DFR基因表达不明显，DFR基因表达水平呈低水平状态。在苹果果实中，bHLH基因可激活CHS、DFR和ANS等结构基因的表达，从而促进花青素的合成与积累（冯晓明，2011）；在拟南芥中，TT8（bHLH）与CHS、CHI、F3H和DFR基因可直接相互作用（Burbulis and Winkel-Shirley，1999；Baudry et al.，2004）。本研究也发现PAL、CHS和ANS基因的表达水平与bHLH基因一致，由此猜测，bHLH基因可能是通过激活PAL、CHS和ANS等结构基因来调控花青素的生物合成过程，但其作用机制有待进一步研究。
4 结论
蓝果忍冬含8种花青素，以矢车菊为苷元的花青素种类最多，其PAL、ANS和bHLH基因在花青素合成过程中起调控作用。蓓蕾、HSY-4和日本-5的花青素合成相关基因表达情况相似，但品种间存在差异。
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（責任编辑 陈 燕）