目的:建立高效液相色谱法同时测定怀牛膝中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa的含量。方法:采用ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,以乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）为流动相,梯度洗脱,流速1.0 m L·min^-1,检测波长250 nm（β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮）和203 nm（人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa）。结果:5个分析物分离良好,β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa进样量分别在0.218².725μg（r=0.999 8）、0.080⁰.995μg（r=0.999 9）、0.155¹.935μg（r=0.999 9）、0.352⁴.400μg（r=0.999 8）和0.338⁴.225μg（r=0.999 8）范围内呈良好的线性关系,加样回收率分别为98.3%、101.5%、98.4%、99.3%和101.4%,相应的RSD分别为0.89%、0.93%、1.4%、0.69%和1.3%;16批不同产地的怀牛膝中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa的含量范围分别为0.032%⁰.074%、0.008%⁰.017%、0.008%⁰.017%、0.044%⁰.107%和0.047%⁰.103%。结论:本方法可作为评价怀牛膝质量的方法。