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摘要：我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV），常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白（coat protein，CP）基因全长设计引物，通过RTPCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段，测序结果显示序列同源性96%以上；针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物，在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增，得到421、202、516、330 bp的特异性条带，优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RTPCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RTPCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。
关键词：分子检测； 多重RTPCR； 马铃薯病毒
中图分类号： S 435.32
文献标识码： A
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是甘肃省除小麦、玉米外的第三大粮食作物[1]。随着产业发展和种植面积扩大，马铃薯病害逐年加重，特别是病毒病害，其导致品质和产量下降甚至引起品种退化[2]。已报道的马铃薯病毒、类病毒达40多种，其中危害严重的有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）等，调查研究发现PVY、PVX、PVS及PLRV通常复合侵染马铃薯[35]使其危害加剧，需要可靠、方便、经济的检测方法。
马铃薯病毒检测的分子生物学技术主要有：RTPCR检测技术[67]、指示分子NASBA检测技术[8]和核酸杂交检测技术[9]三大类，其中RTPCR技术具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，可进行大批量的样本检测，克服了指示植物法、血清学鉴定、电镜法鉴定以及其他检测方法中的一些缺点，比如检测周期长、敏感度低、价格昂贵、技术条件要求高、工作量大[10]。常用的单重RTPCR检测，在1个反应管中只能扩增1种核酸片段，如要检测复合侵染样品中的几种病毒时，则需进行多次RTPCR反应，操作步骤繁琐、易造成交叉污染，不能满足现代检测的需求。多重PCR是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，多重PCR不仅有单重PCR的特异性和灵敏度[1112]而且更具经济性[13]。现在已广泛应用于基因分型和植物病毒的检测与鉴别。王凤格等[14]利用多重PCR技术提高了玉米DNA指纹库的构建效率，郑轩等[15]应用多重PCR技术开展了对5种烟草病毒的检测研究，范旭东等[16]建立了葡萄病毒病害的多重PCR同步检测技术。本文针对马铃薯4种病毒建立了特异、高效的多重PCR检测体系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
2012年7月从甘肃省农业科学院马铃薯研究所会川马铃薯育种实验基地随机采集可能被病毒感染，有明显花叶、皱缩、矮化等症状的马铃薯叶片，按照疑似病毒种类分别装在洁净塑料袋中，保存于-70 ℃低温冰箱。以实验室保存的脱毒马铃薯试管苗作为阴性材料。
植物RNA提取试剂盒购自Omega公司， RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自Thermo公司，Universal DNA Purification Kit DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，Taq DNA聚合酶、pMD19T vector、氨苄青霉素、Xgal、IPTG、限制性内切酶等均购自TaKaRa（大连）宝生物有限公司，E.coli DH5α菌株为本实验室保存。
1.2 引物合成
通过查询GenBank中马铃薯4种病毒（PVX、PVY、PVS 和PLRV）CP基因序列，利用NCBI BLAST分别比对不同国家及地区已发表的PVX、PVY、PVS和PLRV的CP基因序列，寻找每种病毒各自的保守片段，利用Primer 6.0和多因素引物特异性评估系统MFEprimer 2.0[1718]分析引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 总RNA提取
采用Omega公司Plant RNA Kit试剂盒提取疑似带毒马铃薯叶片和脱毒马铃薯叶片的总RNA作为待测的病毒RNA和阴性对照。提取步骤参照试剂盒说明书。
1.4 cDNA合成
反转录体系总体积20 μL，其中RNA 5 μL，Oligo（dT）18 引物（100 μmol/L）1 μL[19]，随机引物（100 μmol/L）1 μL，DEPC H2O 5 μL，先将这12 μL混合后在65 ℃放置5 min，然后冰上放置5 min，再加入5×反应缓冲液 4 μL，RNA酶抑制剂（20 U/μL）1 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，逆转录酶（200 U/μL）1 μL。在42 ℃反应60 min，70 ℃放置5 min，-20 ℃保存。
1.5 病毒CP全长基因扩增体系
PCR反应体系（25 μL）：17 μL dd H2O，2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2 Plus），2 μL dNTP（各2.5 mmol/L），上游和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和2 μL cDNA模板。PCR反应循环参数为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，温度分别为：PVYcp 52.3 ℃、PVScp 54 ℃、PVXcp 53.4 ℃、PLRVcp 52.2 ℃，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min。取8 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。 1.6 PCR产物的克隆和测序
PVY、PVS、PVX和PLRV的CP基因全长片段用天根DNA纯化提取试剂盒回收纯化，然后与pMD19T vector 4 ℃过夜连接，采用CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp（100 mg/L）、XGal（20 g/L）和IPTG（50 g/L）的LB平板培养基上，37 ℃培养14～16 h，4 ℃放置2 h后进行蓝白斑筛选。挑取阳性克隆提取质粒，放置-20 ℃保存，质粒经酶切和PCR验证后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。
1.7 多重PCR反应
将分别含有PVYcp、PVXcp、PVScp和PLRVcp全长序列的质粒混合，作为多重RTPCR反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管作为混合引物（表1）。多重PCR反应体系（25 μL）：19 μL ddH2O，2.5 μL 10 ×PCR buffer（Mg2 Plus），0.5 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.5 μL上下游混合引物，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.5 μL 二甲基亚砜（DMSO）和1.5 μL混合质粒模板。PCR反应循环参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸15 min。取8 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。
1.8 MFEprimer 2.0的使用和多重PCR反应体系优化
使用在线MFEprimer 2.0评估引物和模板特异性结合能力[20]，对引物序列可能产生的非特异性扩增进行预测并虚拟出多重PCR电泳结果。多重PCR扩增效果的影响因素主要包括反应体系和反应条件二大类[21]，其中反应体系包括引物、缓冲液、模板和Taq DNA 聚合酶、dNTP、辅助剂等，反应条件包括退火温度、循环数等。
1.9 田间样品检测
对田间样品进行多重RTPCR 检测，验证多重RTPCR 检测效果。
2 结果与分析
2.1 病毒RNA质量的检测结果
用Plant RNA Kit植物RNA提取试剂盒可从患病叶片上提取到较完整的总RNA，在凝胶中可见28S、18S和5S 3条清晰的条带，提取的总RNA满足后续试验要求。提取样品RNA的A260/A280比值在1.7～1.9，表明组织中的蛋白质和酚类物质基本去除，所提取的RNA纯度较理想，可用于后续研究。
2.2 病毒CP全长基因扩增结果
以PVX、PVY、PVS、PLRV 4 种病毒的反转录产物cDNA作为PCR反应的模板，分别使用各病毒特异性引物扩增得到4种病毒PLRV、PVS、PVX、PVY的CP基因全长片段。2%琼脂糖凝胶电泳检测分别得到大小为628、931、831、858 bp的4条特异性条带（图1）。电泳结果表明，PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长的扩增产物大小与引物设计产物大小相同。
2.3 PCR产物序列分析
割胶回收扩增的PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长片段，与pMD19T vector进行连接，导入感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，质粒经酶切和PCR验证后测序。测序结果经BLAST分析表明所得序列与NCBI参考序列的同源性分别达到96%、99%、97%、99%，证明了RTPCR检测结果的可靠性。
2.4 建立多重RTPCR
将含有PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长的质粒按照1∶1∶1∶1比例混合成为PCR模板，并作为阳性对照。针对PVX、PVY、PVS、PLRV的CP保守基因设计引物（表1），经单重PCR扩增分别得到大小为138、421、516和330 bp的4条特异性条带。先采用和单重PCR相同的反应体系，4对引物按照1∶1∶1∶1比例配成混合引物，25 μL体系中加入1 μL混合引物，采用54 ℃的退火温度，混合质粒作为模板，脱毒马铃薯cDNA作为阴性对照。多重PCR结果显示阴性对照未扩增出条带，PVX和PVS条带较弱，PLRV与PVX之间有隐约出现非特异性条带。
2.5 多重RTPCR反应体系优化
2.5.1 dNTP浓度优化
在多重PCR反应中，dNTP浓度过高时PCR的反应将会被迅速抑制而且容易出现非特异性条带。当dNTP的浓度过低时，扩增目的片段的产量将会大大降低。在25 μL反应体系中dNTP由0.75 μL降低到0.5 μL后，PLRV与PVX条带之间非特异性条带消失，25 μL PCR反应体系中加入0.5 μL dNTP，dNTP终浓度为0.05 mmol/L时扩增效果最好。
2.5.2 多重PCR反应引物优化
多重PCR反应中引物的设计至关重要，引物的特异性、几对引物的退火温度、引物间的配对、各目的片段之间的非特异性扩增均影响多重PCR的扩增效果。设计引物时应考虑：（1）根据CP基因的高度保守区设计4对引物，引物相互之间及与其他病毒之间均无同源性；（2）各对引物的最佳退火温度尽量一致，相差最多不超过3 ℃；（3）目的条带之间大小不要差距过大，彼此差距应保持在100 bp之内，这样各目的条带能有相近的扩增效率，并且凝胶电泳易辨别区分。先用Primer 6.0设计搜索引物，然后MFEprimer 2.0分析评价引物。MFEprimer 2.0是基于多因素（序列相似性、引物3′端稳定性、Tm值、自由能、PCR反应离子浓度等）的引物特异性评估系统，而且可以通过基于引物与模板的相似性分析来预测非特异性PCR产物[21]。重新设计引物，将PVX扩增片段大小由138 bp改为202 bp，在相同的扩增条件下4种病毒条带都很亮，利用模拟电泳图预先观察电泳检测结果（图2）。实际电泳结果与模拟电泳结果一致。 2.5.3 辅助剂
使用一定浓度的辅助剂能够改进多重PCR反应的特异性。在多重PCR反应中，4%～10%的DMSO可改进某些目的片段的扩增效率，但同时也会减少其他目的片段的扩增。在PCR反应体系中加入1 μL PCR辅助剂DMSO[2122]，结果显示4条扩增条带均变亮，获得较好的扩增效果。
2.6 多重RTPCR反应条件优化
反应条件包括退火温度、循环数等，刘正斌[13]和王凤格[14]等人的研究表明在单一PCR扩增已经成功的条件下，遵循引物组合的一般原则，应用与单一PCR完全相同的反应条件进行多重PCR反应，结果大部分组合都得到了正常的扩增结果。所以只要选用与稳定有效的单一PCR相同的反应条件，并遵循引物组合的一般原则，就能够直接应用到多重PCR中去，而不需要进行大量繁琐的优化程序。
在多重PCR反应中，退火温度是一个最重要的调整因素。在设计引物时就应该考虑将各对引物退火温度控制在一个相近的范围内，本试验设计PVX退火温度是55 ℃，PLRV退火温度是57.5 ℃，PVY退火温度是56.3 ℃，PVS退火温度是57 ℃，各引物的退火温度接近。Henegariu等[23]的研究表明，尽管单个目的片段能够在56～60 ℃特异性地扩增，但是在多重PCR反应中，降低2～4 ℃的退火温度能够更好地用于所有目的片段的扩增。使用55 ℃作为多重PCR退火温度，结果显示所获得的目的条带较好。
循环内延伸时间为1 min，最后的延伸时间为15 min扩增效果较好，扩增产物加尾整齐。循环次数30次就能有效获得特异而清晰的目的条带。因此，优化后反应条件最终选择退火温度55 ℃，循环内延伸时间1 min，最后延伸15 min，30次循环。最终的优化结果见图3。
2.7 多重PCR检测体系特异性检测
选用田间感染马铃薯的常见病对建立的多重PCR检测体系的特异性进行验证，提取马铃薯环腐病、马铃薯晚疫病、马铃薯青枯病、马铃薯灰霉病的DNA，以马铃薯A病毒和马铃薯类病毒RNA作为模板。结果显示建立的多重PCR检测体系在选择的几种病害中均未扩增出条带，说明针对马铃薯4种病毒的多重PCR检测体系的特异性较好。
2.8 田间样品检测
采用优化后的多重RTPCR检测技术对田间样品进行检测，同时设置阳性和阴性对照。结果显示，阳性对照完整扩增出4条条带，阴性对照脱毒马铃薯中未扩增出任何条带，样品2和样品6未扩增出4种病毒特异性条带，样品3、4和5扩增出PVS和PVY两种病毒条带，样品7扩增出PVY和PLRV两种病毒条带（图4），表明4份样品存在复合病毒侵染。
3 结论与讨论
目前应用最广的病毒检测法是以病毒抗血清为基础的酶联免疫（ELISA）法。ELISA法比传统的检测方法灵敏度提高了许多，但存在假阳性或假阴性现象，也无法区分因外壳蛋白基因有一定同源性的病毒类型，并且无法检测含量极少的韧皮部病毒及休眠种薯中的病毒。反转录聚合酶链式反应（RTPCR）具有灵敏、快速、特异性强等优点，多重RTPCR继承了单重PCR反应的优点，能同时在一个PCR反应中扩增出多个核酸片段，节省了模板、时间和费用，在检测由复合病毒引起的病害时显示出其优势。
建立多重RTPCR体系要比单重RTPCR复杂得多，其中至关重要的原因是引物的设计[24]。多重RTPCR的引物设计建议如下：（1）根据基因的高度保守区设计引物，引物相互之间及与其他基因之间均无同源性；（2）各对引物的最佳退火温度尽量一致，相差最多不超过3 ℃；（3）目的条带之间大小不要差距过大，应保持在100 bp左右，这样各目的条带能有相近的扩增效率，同时凝胶电泳结果应易辨别区分；（4）用Primer 6.0设计搜索引物，MFEprimer 2.0分析评价引物并模拟电泳的结果；（5）选用与稳定有效的单一PCR相同的反应条件。这样就能够直接应用到多重PCR中去，不需要进行大量繁琐的优化程序。
对吴兴泉等[25]提出的多重RTPCR检测马铃薯病毒中出现假阴性、假阳性、非特异性扩增问题，本研究都做了针对性的优化，在引物设计就已经尽可能将已公布的基因序列全部用于保守区的分析，本试验用混合有4种病毒CP全长基因的质粒作为阳性对照，电泳时能够直观地看到阳性检测结果，而且避免了因为试验操作不当或者反应试剂问题导致的假阴性。对PCR试验中所出现的假阳性DNA产物也能通过MFEprimer 2.0进行分析模拟电泳结果。本试验建立的多重RTPCR检测体系能够准确、特异地检测复合侵染马铃薯的4种病毒，简化了病毒检测的工作量，进一步降低了成本，对于生产实践有着重要的意义。
参考文献
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关键词：分子检测； 多重RTPCR； 马铃薯病毒
中图分类号： S 435.32
文献标识码： A
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是甘肃省除小麦、玉米外的第三大粮食作物[1]。随着产业发展和种植面积扩大，马铃薯病害逐年加重，特别是病毒病害，其导致品质和产量下降甚至引起品种退化[2]。已报道的马铃薯病毒、类病毒达40多种，其中危害严重的有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）等，调查研究发现PVY、PVX、PVS及PLRV通常复合侵染马铃薯[35]使其危害加剧，需要可靠、方便、经济的检测方法。
马铃薯病毒检测的分子生物学技术主要有：RTPCR检测技术[67]、指示分子NASBA检测技术[8]和核酸杂交检测技术[9]三大类，其中RTPCR技术具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，可进行大批量的样本检测，克服了指示植物法、血清学鉴定、电镜法鉴定以及其他检测方法中的一些缺点，比如检测周期长、敏感度低、价格昂贵、技术条件要求高、工作量大[10]。常用的单重RTPCR检测，在1个反应管中只能扩增1种核酸片段，如要检测复合侵染样品中的几种病毒时，则需进行多次RTPCR反应，操作步骤繁琐、易造成交叉污染，不能满足现代检测的需求。多重PCR是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，多重PCR不仅有单重PCR的特异性和灵敏度[1112]而且更具经济性[13]。现在已广泛应用于基因分型和植物病毒的检测与鉴别。王凤格等[14]利用多重PCR技术提高了玉米DNA指纹库的构建效率，郑轩等[15]应用多重PCR技术开展了对5种烟草病毒的检测研究，范旭东等[16]建立了葡萄病毒病害的多重PCR同步检测技术。本文针对马铃薯4种病毒建立了特异、高效的多重PCR检测体系，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
2012年7月从甘肃省农业科学院马铃薯研究所会川马铃薯育种实验基地随机采集可能被病毒感染，有明显花叶、皱缩、矮化等症状的马铃薯叶片，按照疑似病毒种类分别装在洁净塑料袋中，保存于-70 ℃低温冰箱。以实验室保存的脱毒马铃薯试管苗作为阴性材料。
植物RNA提取试剂盒购自Omega公司， RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自Thermo公司，Universal DNA Purification Kit DNA纯化回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，Taq DNA聚合酶、pMD19T vector、氨苄青霉素、Xgal、IPTG、限制性内切酶等均购自TaKaRa（大连）宝生物有限公司，E.coli DH5α菌株为本实验室保存。
1.2 引物合成
通过查询GenBank中马铃薯4种病毒（PVX、PVY、PVS 和PLRV）CP基因序列，利用NCBI BLAST分别比对不同国家及地区已发表的PVX、PVY、PVS和PLRV的CP基因序列，寻找每种病毒各自的保守片段，利用Primer 6.0和多因素引物特异性评估系统MFEprimer 2.0[1718]分析引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 总RNA提取
采用Omega公司Plant RNA Kit试剂盒提取疑似带毒马铃薯叶片和脱毒马铃薯叶片的总RNA作为待测的病毒RNA和阴性对照。提取步骤参照试剂盒说明书。
1.4 cDNA合成
反转录体系总体积20 μL，其中RNA 5 μL，Oligo（dT）18 引物（100 μmol/L）1 μL[19]，随机引物（100 μmol/L）1 μL，DEPC H2O 5 μL，先将这12 μL混合后在65 ℃放置5 min，然后冰上放置5 min，再加入5×反应缓冲液 4 μL，RNA酶抑制剂（20 U/μL）1 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，逆转录酶（200 U/μL）1 μL。在42 ℃反应60 min，70 ℃放置5 min，-20 ℃保存。
1.5 病毒CP全长基因扩增体系
PCR反应体系（25 μL）：17 μL dd H2O，2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2 Plus），2 μL dNTP（各2.5 mmol/L），上游和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和2 μL cDNA模板。PCR反应循环参数为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，温度分别为：PVYcp 52.3 ℃、PVScp 54 ℃、PVXcp 53.4 ℃、PLRVcp 52.2 ℃，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min。取8 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。 1.6 PCR产物的克隆和测序
PVY、PVS、PVX和PLRV的CP基因全长片段用天根DNA纯化提取试剂盒回收纯化，然后与pMD19T vector 4 ℃过夜连接，采用CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp（100 mg/L）、XGal（20 g/L）和IPTG（50 g/L）的LB平板培养基上，37 ℃培养14～16 h，4 ℃放置2 h后进行蓝白斑筛选。挑取阳性克隆提取质粒，放置-20 ℃保存，质粒经酶切和PCR验证后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。
1.7 多重PCR反应
将分别含有PVYcp、PVXcp、PVScp和PLRVcp全长序列的质粒混合，作为多重RTPCR反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管作为混合引物（表1）。多重PCR反应体系（25 μL）：19 μL ddH2O，2.5 μL 10 ×PCR buffer（Mg2 Plus），0.5 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.5 μL上下游混合引物，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），0.5 μL 二甲基亚砜（DMSO）和1.5 μL混合质粒模板。PCR反应循环参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸15 min。取8 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。
1.8 MFEprimer 2.0的使用和多重PCR反应体系优化
使用在线MFEprimer 2.0评估引物和模板特异性结合能力[20]，对引物序列可能产生的非特异性扩增进行预测并虚拟出多重PCR电泳结果。多重PCR扩增效果的影响因素主要包括反应体系和反应条件二大类[21]，其中反应体系包括引物、缓冲液、模板和Taq DNA 聚合酶、dNTP、辅助剂等，反应条件包括退火温度、循环数等。
1.9 田间样品检测
对田间样品进行多重RTPCR 检测，验证多重RTPCR 检测效果。
2 结果与分析
2.1 病毒RNA质量的检测结果
用Plant RNA Kit植物RNA提取试剂盒可从患病叶片上提取到较完整的总RNA，在凝胶中可见28S、18S和5S 3条清晰的条带，提取的总RNA满足后续试验要求。提取样品RNA的A260/A280比值在1.7～1.9，表明组织中的蛋白质和酚类物质基本去除，所提取的RNA纯度较理想，可用于后续研究。
2.2 病毒CP全长基因扩增结果
以PVX、PVY、PVS、PLRV 4 种病毒的反转录产物cDNA作为PCR反应的模板，分别使用各病毒特异性引物扩增得到4种病毒PLRV、PVS、PVX、PVY的CP基因全长片段。2%琼脂糖凝胶电泳检测分别得到大小为628、931、831、858 bp的4条特异性条带（图1）。电泳结果表明，PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长的扩增产物大小与引物设计产物大小相同。
2.3 PCR产物序列分析
割胶回收扩增的PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长片段，与pMD19T vector进行连接，导入感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，质粒经酶切和PCR验证后测序。测序结果经BLAST分析表明所得序列与NCBI参考序列的同源性分别达到96%、99%、97%、99%，证明了RTPCR检测结果的可靠性。
2.4 建立多重RTPCR
将含有PVX、PVY、PVS、PLRV 4种病毒CP基因全长的质粒按照1∶1∶1∶1比例混合成为PCR模板，并作为阳性对照。针对PVX、PVY、PVS、PLRV的CP保守基因设计引物（表1），经单重PCR扩增分别得到大小为138、421、516和330 bp的4条特异性条带。先采用和单重PCR相同的反应体系，4对引物按照1∶1∶1∶1比例配成混合引物，25 μL体系中加入1 μL混合引物，采用54 ℃的退火温度，混合质粒作为模板，脱毒马铃薯cDNA作为阴性对照。多重PCR结果显示阴性对照未扩增出条带，PVX和PVS条带较弱，PLRV与PVX之间有隐约出现非特异性条带。
2.5 多重RTPCR反应体系优化
2.5.1 dNTP浓度优化
在多重PCR反应中，dNTP浓度过高时PCR的反应将会被迅速抑制而且容易出现非特异性条带。当dNTP的浓度过低时，扩增目的片段的产量将会大大降低。在25 μL反应体系中dNTP由0.75 μL降低到0.5 μL后，PLRV与PVX条带之间非特异性条带消失，25 μL PCR反应体系中加入0.5 μL dNTP，dNTP终浓度为0.05 mmol/L时扩增效果最好。
2.5.2 多重PCR反应引物优化
多重PCR反应中引物的设计至关重要，引物的特异性、几对引物的退火温度、引物间的配对、各目的片段之间的非特异性扩增均影响多重PCR的扩增效果。设计引物时应考虑：（1）根据CP基因的高度保守区设计4对引物，引物相互之间及与其他病毒之间均无同源性；（2）各对引物的最佳退火温度尽量一致，相差最多不超过3 ℃；（3）目的条带之间大小不要差距过大，彼此差距应保持在100 bp之内，这样各目的条带能有相近的扩增效率，并且凝胶电泳易辨别区分。先用Primer 6.0设计搜索引物，然后MFEprimer 2.0分析评价引物。MFEprimer 2.0是基于多因素（序列相似性、引物3′端稳定性、Tm值、自由能、PCR反应离子浓度等）的引物特异性评估系统，而且可以通过基于引物与模板的相似性分析来预测非特异性PCR产物[21]。重新设计引物，将PVX扩增片段大小由138 bp改为202 bp，在相同的扩增条件下4种病毒条带都很亮，利用模拟电泳图预先观察电泳检测结果（图2）。实际电泳结果与模拟电泳结果一致。 2.5.3 辅助剂
使用一定浓度的辅助剂能够改进多重PCR反应的特异性。在多重PCR反应中，4%～10%的DMSO可改进某些目的片段的扩增效率，但同时也会减少其他目的片段的扩增。在PCR反应体系中加入1 μL PCR辅助剂DMSO[2122]，结果显示4条扩增条带均变亮，获得较好的扩增效果。
2.6 多重RTPCR反应条件优化
反应条件包括退火温度、循环数等，刘正斌[13]和王凤格[14]等人的研究表明在单一PCR扩增已经成功的条件下，遵循引物组合的一般原则，应用与单一PCR完全相同的反应条件进行多重PCR反应，结果大部分组合都得到了正常的扩增结果。所以只要选用与稳定有效的单一PCR相同的反应条件，并遵循引物组合的一般原则，就能够直接应用到多重PCR中去，而不需要进行大量繁琐的优化程序。
在多重PCR反应中，退火温度是一个最重要的调整因素。在设计引物时就应该考虑将各对引物退火温度控制在一个相近的范围内，本试验设计PVX退火温度是55 ℃，PLRV退火温度是57.5 ℃，PVY退火温度是56.3 ℃，PVS退火温度是57 ℃，各引物的退火温度接近。Henegariu等[23]的研究表明，尽管单个目的片段能够在56～60 ℃特异性地扩增，但是在多重PCR反应中，降低2～4 ℃的退火温度能够更好地用于所有目的片段的扩增。使用55 ℃作为多重PCR退火温度，结果显示所获得的目的条带较好。
循环内延伸时间为1 min，最后的延伸时间为15 min扩增效果较好，扩增产物加尾整齐。循环次数30次就能有效获得特异而清晰的目的条带。因此，优化后反应条件最终选择退火温度55 ℃，循环内延伸时间1 min，最后延伸15 min，30次循环。最终的优化结果见图3。
2.7 多重PCR检测体系特异性检测
选用田间感染马铃薯的常见病对建立的多重PCR检测体系的特异性进行验证，提取马铃薯环腐病、马铃薯晚疫病、马铃薯青枯病、马铃薯灰霉病的DNA，以马铃薯A病毒和马铃薯类病毒RNA作为模板。结果显示建立的多重PCR检测体系在选择的几种病害中均未扩增出条带，说明针对马铃薯4种病毒的多重PCR检测体系的特异性较好。
2.8 田间样品检测
采用优化后的多重RTPCR检测技术对田间样品进行检测，同时设置阳性和阴性对照。结果显示，阳性对照完整扩增出4条条带，阴性对照脱毒马铃薯中未扩增出任何条带，样品2和样品6未扩增出4种病毒特异性条带，样品3、4和5扩增出PVS和PVY两种病毒条带，样品7扩增出PVY和PLRV两种病毒条带（图4），表明4份样品存在复合病毒侵染。
3 结论与讨论
目前应用最广的病毒检测法是以病毒抗血清为基础的酶联免疫（ELISA）法。ELISA法比传统的检测方法灵敏度提高了许多，但存在假阳性或假阴性现象，也无法区分因外壳蛋白基因有一定同源性的病毒类型，并且无法检测含量极少的韧皮部病毒及休眠种薯中的病毒。反转录聚合酶链式反应（RTPCR）具有灵敏、快速、特异性强等优点，多重RTPCR继承了单重PCR反应的优点，能同时在一个PCR反应中扩增出多个核酸片段，节省了模板、时间和费用，在检测由复合病毒引起的病害时显示出其优势。
建立多重RTPCR体系要比单重RTPCR复杂得多，其中至关重要的原因是引物的设计[24]。多重RTPCR的引物设计建议如下：（1）根据基因的高度保守区设计引物，引物相互之间及与其他基因之间均无同源性；（2）各对引物的最佳退火温度尽量一致，相差最多不超过3 ℃；（3）目的条带之间大小不要差距过大，应保持在100 bp左右，这样各目的条带能有相近的扩增效率，同时凝胶电泳结果应易辨别区分；（4）用Primer 6.0设计搜索引物，MFEprimer 2.0分析评价引物并模拟电泳的结果；（5）选用与稳定有效的单一PCR相同的反应条件。这样就能够直接应用到多重PCR中去，不需要进行大量繁琐的优化程序。
对吴兴泉等[25]提出的多重RTPCR检测马铃薯病毒中出现假阴性、假阳性、非特异性扩增问题，本研究都做了针对性的优化，在引物设计就已经尽可能将已公布的基因序列全部用于保守区的分析，本试验用混合有4种病毒CP全长基因的质粒作为阳性对照，电泳时能够直观地看到阳性检测结果，而且避免了因为试验操作不当或者反应试剂问题导致的假阴性。对PCR试验中所出现的假阳性DNA产物也能通过MFEprimer 2.0进行分析模拟电泳结果。本试验建立的多重RTPCR检测体系能够准确、特异地检测复合侵染马铃薯的4种病毒，简化了病毒检测的工作量，进一步降低了成本，对于生产实践有着重要的意义。
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