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摘要 [目的] 研究玉米胚性愈伤组织长期继代培育的特性变化。[方法]以5种基因型的胚性愈伤组织为材料研究它们继代10次与20次的特性变化。 [结果]继代20次愈伤组织的单个培养周期生长量、胚性愈伤组织比率和愈伤组织幼苗再生率和继代10次愈伤组织相比均有下降，但变化幅度因基因型或愈伤组织类型而不同。Ⅰ型愈伤组织继代20次后生长量、胚性愈伤组织比率下降明显，而Ⅱ型愈伤组织相对稳定。[结论]与Ⅰ型愈伤组织相比，玉米Ⅱ型愈伤组织是建立长期玉米组织培养体系的理想材料。
关键词 玉米;愈伤组织;继代培育;生长量;胚性愈伤;再生率
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）32-11236-02
Effect of Longterm Subculture on Callus from Maize Immature Embryo
DENG Shizheng1， DONG Zhongdong2， LIU Guizhen1，CUI Dangqun2* et al
（1. Seed Station of Henan Province， Zhengzhou，Henan 450046; 2.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450002 ）
Abstract [Objective] The calluses quality changes were studied in longterm subculture condition. [Method] Calluses derived from five maize genotypes were used to investigate the calluses quality change after 10 and 20 times subculture. [Result]The result showed that the growing capacity， embryogenic callus rate， regeneration frequency of callus with 20 times subculture declined significantly compared with those of callus with 10 times subculture. The declines of type Ⅰ calluses which derived from three genotypes were significant， but that of type Ⅱ callus which derived from two genotypes were not. [Conclusion]This demonstrate that during long term subculture， quality of type Ⅱ callus is steady，that of type Ⅰcallus is changeable. So type Ⅱ callus is more ideal for establishing the long term culture system than the type Ⅰcallus.
Key words Maize;Embryogenic callus; Subculture; Growth amount;Embryogenic callus;Regeneration frequency
作者簡介 邓士政（1960- ），男，河南孟州人，高级农艺师，博士，从事生物技术与品种试验研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事作物遗传育种教学与研究。
收稿日期 20140930
玉米组织培养体系是玉米遗传转化、突变体筛选和细胞遗传学研究的基础[1-5]。Armstrong将玉米愈伤组织分为3类，不同类型的愈伤组织的培养特性不同，其中I型愈伤组织和Ⅱ型愈伤组织被称为胚性愈伤组织，可以作为建立玉米离体培养体系的基础材料[5-8]。胚性愈伤组织长期继代不仅可以省去每年田间种植幼胚供体材料和胚性愈伤组织诱导、筛选的麻烦，而且有利于进行突变体的长期筛选、优良材料的大量扩增和便于灵活掌握遗传转化时间。因此，研究胚性愈伤组织长期继代培育的特性变化，对研究玉米组织培养体系建立及利用具有实际意义。笔者以5种基因型的胚性愈伤组织为材料，研究不同长度继代时间对不同类型愈伤组织胚性、生长量、再生能力的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
郑22和齐319 2个自交系和871×郑22、87-1×齐319、齐319×HiⅡA 3个杂交种的幼胚愈伤组织为长期继代培养的研究材料，其中齐319和齐319×HiⅡA基因型的愈伤组织为Ⅱ型，其他3种基因型的愈伤组织为Ⅰ型胚性愈伤组织。
1.2 培养基
继代培养基：N6+2 mg/L 2，4D +500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;
再生培养基：N6+1 mg/L 6BA+1 mg/L KT+500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖。
1.3 试验方法
幼胚愈伤组织每培养21 d为一个继代周期，筛选胚性愈伤组织转换新培养基。在继代10次和20次时分别测定愈伤组织培养21 d的生长量、胚性愈伤率。所有继代均采用26 ℃暗培养。生长量测定采用随机重复设计，重复4次，在转接继代时用分析天平称量接入新继代培养基的愈伤组织质量，在培养21 d时称量培养后的愈伤组织质量，然后按下列公式计算生长量： 生长量（g/g）=
继代培养后愈伤组织质量（g）-接入愈伤组织质量（g）接入愈伤组织质量（g）
按照ARMSTRONG[5] 描述玉米愈伤组织分类标准调查愈伤类型后，计算胚性愈伤率。
分别在继代10次和20次的上述基因型愈伤组织分化培养基上，每皿接入15块愈伤组织，26 ℃、14 h/d光照下培养28 d后调查统计再生幼苗数，并按下列公式计算再生率。
再生率（%）=再生幼苗愈伤数诱导再生愈伤组织块数×100
2 结果与分析
2.1 长期继代培养对玉米愈伤组织生长量的影响
继代培养10次和20次的5种玉米基因型愈伤组织转接相同培养基上培养21 d后愈伤组织生长量在继代次数、基因型间和继代次数与基因型互作间均有显著差异。5种基因型继代10次的愈伤组织一个继代周期平均生长量为3.23 g/g，比继代20次的愈伤组织平均生长量2.46 g/g多0.77 g，达到极显著水平。除齐319和郑22间差异不显著外，其余基因型间愈伤组织生长差异均达到显著水平;3个杂交种的平均愈伤组织生长量分别显著高于自交系郑22和齐319，证明愈伤组织生长具有杂种优势（图1）。
不同继代次数的愈伤组织生长能力差异因基因型及愈伤类型而不同，齐319和齐319×HiⅡA 2个基因型的Ⅱ型愈伤组织2个继代次数愈伤组织的生长量差异很小，继代10次的愈伤组织生长量略高于继代20次的愈伤组织;郑22、871×郑22和871×齐319 3种基因型的Ⅰ型胚性愈伤组织继代10次的愈伤组织生长量为2.14、3.89和4.28 g/g，分别比它们继代20次愈伤组织生长量多0.74、1.46和1.37 g，达到极显著水平（图1）。表明不同类型愈伤组织对长期继代培养反应不同，Ⅱ型愈伤组织长期继代生长能力相对稳定，而Ⅰ型胚性愈伤组织下降明显。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图1 不同品种及不同继代次数愈伤组织生长量差异比较
2.2 长期继代培养对胚性愈伤率的影响
胚性愈伤率在继代次数、基因型和继代次数×基因型互作效应间差异达极显著水平。5种基因型愈伤组织继代培养10次后平均胚性愈伤率为85.17%，而继代20次胚性愈伤率为74.58%，比前者降低10.59%。871×齐319和齐319×HiⅡA 2个基因型平均胚性愈伤率分别为85.17%、85.21%，两者差异不显著，但显著高于其他基因型;871×鄭22和齐319 2基因型平均胚性愈伤率分别为79.79%、78.13%，差异不显著，但显著高于郑22（70.42%）（图2）。5种基因型愈伤组织2种不同继代次数的胚性愈伤率变化不同，齐319和齐319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈伤组织，继代次数间胚性愈伤率变化很小，达不到显著水平;这2种基因型愈伤组织继代中的非胚性愈伤组织表现白化或光下变紫。郑22、871×郑22和871×齐319 3种基因型的Ⅰ型胚性愈伤组织，继代20次的胚性愈伤率分别为61.25%、71.67%、80.42%，分别比继代10次的胚性愈伤率降低18.33%、16.25%、10.83%，差异达极显著水平（图2）。这3种基因型愈伤组织继代中的非胚性愈伤组织表现为褐变。可见，长期继代培养易造成胚性愈伤组织转化为非胚性愈伤组织，而这种变化Ⅰ型胚性愈伤组织较大。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图2 长期继代培养对玉米愈伤组织胚性愈伤率的影响
2.3 长期继代培养对愈伤组织幼苗再生率的影响
将5种玉米基因型的愈伤组织分别在继代10次和20次后转接到再生培养基上进行分化诱导，调查28 d内各自的幼苗数，计算幼苗再生率。对愈伤组织幼苗再生率进行方差分析，结果表明继代次数、基因型和继代次数×基因型互作差异显著。5种基因型继代10次的愈伤组织平均幼苗再生率为32.00%，比继代20次愈伤组织的平均幼苗再生率26.52%高出5.48%，达到极显著水平。5种基因型幼苗再生率由高到低依次为齐319×HiⅡA、齐319、871×齐319、871×郑22、郑22，分别为41.76%、37.04%、30.74%、22.96%、13.80%，它们之间差异均达到极显著水平（图3），说明愈伤组织再生率具有遗传效应。同一基因型不同继代次数的愈伤组织再生率差异表现不同。齐319和齐319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈伤组织2个继代次数再生率差异不显著，而郑22、871×齐319、871×郑22 3种基因型的Ⅰ型愈伤组织继代10次再生率为18.33%、35.00%、28.33%，分别比继代20次的愈伤组织再生率高9.07%、7.41%和9.63%，达到极显著水平（图3）。可见，Ⅰ型愈伤组织长期继代培养再生能力下降，而Ⅱ型愈伤组织长期继代培养再生能力相对稳定。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图3 长期继代培养对愈伤组织幼苗再生率的影响
3 结论与讨论
优良玉米愈伤组织的特点是胚性并具有快速扩繁能力和高再生能力[5-6]。该研究利用2个基因型的Ⅱ型愈伤组织和3种基因型的Ⅰ愈伤组织对10次和20次继代培养后愈伤组织的特性变化进行了研究，证明不同基因型间、不同长度继代培养次数的愈伤组织间在单继代周期的生长量、胚性愈伤率和愈伤组织幼苗再生率3个性状上均存在显著差异（表1）。说明这3个性状具有基因型效应和继代效应。继代20次的愈伤组织生长量、胚性愈伤组织比率和愈伤组织幼苗再生率和继代10次的愈伤组织相比显著下降（图1、2和3）。对同一基因型不同继代培养次数愈伤组织生长量、胚性愈伤组织比率和幼苗再生率差异幅度因基因型或愈伤组织类型而不同。Ⅰ型愈伤组织继代20次后生长量、胚性愈伤组织比
关键词 玉米;愈伤组织;继代培育;生长量;胚性愈伤;再生率
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）32-11236-02
Effect of Longterm Subculture on Callus from Maize Immature Embryo
DENG Shizheng1， DONG Zhongdong2， LIU Guizhen1，CUI Dangqun2* et al
（1. Seed Station of Henan Province， Zhengzhou，Henan 450046; 2.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450002 ）
Abstract [Objective] The calluses quality changes were studied in longterm subculture condition. [Method] Calluses derived from five maize genotypes were used to investigate the calluses quality change after 10 and 20 times subculture. [Result]The result showed that the growing capacity， embryogenic callus rate， regeneration frequency of callus with 20 times subculture declined significantly compared with those of callus with 10 times subculture. The declines of type Ⅰ calluses which derived from three genotypes were significant， but that of type Ⅱ callus which derived from two genotypes were not. [Conclusion]This demonstrate that during long term subculture， quality of type Ⅱ callus is steady，that of type Ⅰcallus is changeable. So type Ⅱ callus is more ideal for establishing the long term culture system than the type Ⅰcallus.
Key words Maize;Embryogenic callus; Subculture; Growth amount;Embryogenic callus;Regeneration frequency
作者簡介 邓士政（1960- ），男，河南孟州人，高级农艺师，博士，从事生物技术与品种试验研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事作物遗传育种教学与研究。
收稿日期 20140930
玉米组织培养体系是玉米遗传转化、突变体筛选和细胞遗传学研究的基础[1-5]。Armstrong将玉米愈伤组织分为3类，不同类型的愈伤组织的培养特性不同，其中I型愈伤组织和Ⅱ型愈伤组织被称为胚性愈伤组织，可以作为建立玉米离体培养体系的基础材料[5-8]。胚性愈伤组织长期继代不仅可以省去每年田间种植幼胚供体材料和胚性愈伤组织诱导、筛选的麻烦，而且有利于进行突变体的长期筛选、优良材料的大量扩增和便于灵活掌握遗传转化时间。因此，研究胚性愈伤组织长期继代培育的特性变化，对研究玉米组织培养体系建立及利用具有实际意义。笔者以5种基因型的胚性愈伤组织为材料，研究不同长度继代时间对不同类型愈伤组织胚性、生长量、再生能力的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
郑22和齐319 2个自交系和871×郑22、87-1×齐319、齐319×HiⅡA 3个杂交种的幼胚愈伤组织为长期继代培养的研究材料，其中齐319和齐319×HiⅡA基因型的愈伤组织为Ⅱ型，其他3种基因型的愈伤组织为Ⅰ型胚性愈伤组织。
1.2 培养基
继代培养基：N6+2 mg/L 2，4D +500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖;
再生培养基：N6+1 mg/L 6BA+1 mg/L KT+500 mg/L脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖。
1.3 试验方法
幼胚愈伤组织每培养21 d为一个继代周期，筛选胚性愈伤组织转换新培养基。在继代10次和20次时分别测定愈伤组织培养21 d的生长量、胚性愈伤率。所有继代均采用26 ℃暗培养。生长量测定采用随机重复设计，重复4次，在转接继代时用分析天平称量接入新继代培养基的愈伤组织质量，在培养21 d时称量培养后的愈伤组织质量，然后按下列公式计算生长量： 生长量（g/g）=
继代培养后愈伤组织质量（g）-接入愈伤组织质量（g）接入愈伤组织质量（g）
按照ARMSTRONG[5] 描述玉米愈伤组织分类标准调查愈伤类型后，计算胚性愈伤率。
分别在继代10次和20次的上述基因型愈伤组织分化培养基上，每皿接入15块愈伤组织，26 ℃、14 h/d光照下培养28 d后调查统计再生幼苗数，并按下列公式计算再生率。
再生率（%）=再生幼苗愈伤数诱导再生愈伤组织块数×100
2 结果与分析
2.1 长期继代培养对玉米愈伤组织生长量的影响
继代培养10次和20次的5种玉米基因型愈伤组织转接相同培养基上培养21 d后愈伤组织生长量在继代次数、基因型间和继代次数与基因型互作间均有显著差异。5种基因型继代10次的愈伤组织一个继代周期平均生长量为3.23 g/g，比继代20次的愈伤组织平均生长量2.46 g/g多0.77 g，达到极显著水平。除齐319和郑22间差异不显著外，其余基因型间愈伤组织生长差异均达到显著水平;3个杂交种的平均愈伤组织生长量分别显著高于自交系郑22和齐319，证明愈伤组织生长具有杂种优势（图1）。
不同继代次数的愈伤组织生长能力差异因基因型及愈伤类型而不同，齐319和齐319×HiⅡA 2个基因型的Ⅱ型愈伤组织2个继代次数愈伤组织的生长量差异很小，继代10次的愈伤组织生长量略高于继代20次的愈伤组织;郑22、871×郑22和871×齐319 3种基因型的Ⅰ型胚性愈伤组织继代10次的愈伤组织生长量为2.14、3.89和4.28 g/g，分别比它们继代20次愈伤组织生长量多0.74、1.46和1.37 g，达到极显著水平（图1）。表明不同类型愈伤组织对长期继代培养反应不同，Ⅱ型愈伤组织长期继代生长能力相对稳定，而Ⅰ型胚性愈伤组织下降明显。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图1 不同品种及不同继代次数愈伤组织生长量差异比较
2.2 长期继代培养对胚性愈伤率的影响
胚性愈伤率在继代次数、基因型和继代次数×基因型互作效应间差异达极显著水平。5种基因型愈伤组织继代培养10次后平均胚性愈伤率为85.17%，而继代20次胚性愈伤率为74.58%，比前者降低10.59%。871×齐319和齐319×HiⅡA 2个基因型平均胚性愈伤率分别为85.17%、85.21%，两者差异不显著，但显著高于其他基因型;871×鄭22和齐319 2基因型平均胚性愈伤率分别为79.79%、78.13%，差异不显著，但显著高于郑22（70.42%）（图2）。5种基因型愈伤组织2种不同继代次数的胚性愈伤率变化不同，齐319和齐319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈伤组织，继代次数间胚性愈伤率变化很小，达不到显著水平;这2种基因型愈伤组织继代中的非胚性愈伤组织表现白化或光下变紫。郑22、871×郑22和871×齐319 3种基因型的Ⅰ型胚性愈伤组织，继代20次的胚性愈伤率分别为61.25%、71.67%、80.42%，分别比继代10次的胚性愈伤率降低18.33%、16.25%、10.83%，差异达极显著水平（图2）。这3种基因型愈伤组织继代中的非胚性愈伤组织表现为褐变。可见，长期继代培养易造成胚性愈伤组织转化为非胚性愈伤组织，而这种变化Ⅰ型胚性愈伤组织较大。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图2 长期继代培养对玉米愈伤组织胚性愈伤率的影响
2.3 长期继代培养对愈伤组织幼苗再生率的影响
将5种玉米基因型的愈伤组织分别在继代10次和20次后转接到再生培养基上进行分化诱导，调查28 d内各自的幼苗数，计算幼苗再生率。对愈伤组织幼苗再生率进行方差分析，结果表明继代次数、基因型和继代次数×基因型互作差异显著。5种基因型继代10次的愈伤组织平均幼苗再生率为32.00%，比继代20次愈伤组织的平均幼苗再生率26.52%高出5.48%，达到极显著水平。5种基因型幼苗再生率由高到低依次为齐319×HiⅡA、齐319、871×齐319、871×郑22、郑22，分别为41.76%、37.04%、30.74%、22.96%、13.80%，它们之间差异均达到极显著水平（图3），说明愈伤组织再生率具有遗传效应。同一基因型不同继代次数的愈伤组织再生率差异表现不同。齐319和齐319×HiⅡA基因型的Ⅱ型愈伤组织2个继代次数再生率差异不显著，而郑22、871×齐319、871×郑22 3种基因型的Ⅰ型愈伤组织继代10次再生率为18.33%、35.00%、28.33%，分别比继代20次的愈伤组织再生率高9.07%、7.41%和9.63%，达到极显著水平（图3）。可见，Ⅰ型愈伤组织长期继代培养再生能力下降，而Ⅱ型愈伤组织长期继代培养再生能力相对稳定。
注：每个基因型左侧2个柱形上方字母表示该基因型不同继代次数间在5%水平下的差异显著情况;右侧柱形上方带短横的字母表示4种不同基因型间在5%水平下的差异显著情况。
图3 长期继代培养对愈伤组织幼苗再生率的影响
3 结论与讨论
优良玉米愈伤组织的特点是胚性并具有快速扩繁能力和高再生能力[5-6]。该研究利用2个基因型的Ⅱ型愈伤组织和3种基因型的Ⅰ愈伤组织对10次和20次继代培养后愈伤组织的特性变化进行了研究，证明不同基因型间、不同长度继代培养次数的愈伤组织间在单继代周期的生长量、胚性愈伤率和愈伤组织幼苗再生率3个性状上均存在显著差异（表1）。说明这3个性状具有基因型效应和继代效应。继代20次的愈伤组织生长量、胚性愈伤组织比率和愈伤组织幼苗再生率和继代10次的愈伤组织相比显著下降（图1、2和3）。对同一基因型不同继代培养次数愈伤组织生长量、胚性愈伤组织比率和幼苗再生率差异幅度因基因型或愈伤组织类型而不同。Ⅰ型愈伤组织继代20次后生长量、胚性愈伤组织比