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摘 要 目的：观察去甲基化制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对人食管癌细胞系OE33中CDH13基因启动子区甲基化状态的影响，探讨OE33中CDH13基因失活的机制及5-Aza-dC对CDH13基因表达的调控作用。方法：5-Aza-dC处理体外培养的OE33细胞，用甲基化特异性PCR(MSP)法检测处理前后细胞中CDH13基因的甲基化状态，半定量RT-PCR法检测用药前后细胞中CDH13 mRNA表达的变化。结果：OE33中CDH13启动子区发现甲基化现象，应用5-Aza-dC能使CDH13基因启动子区CpG岛去甲基化，而且经药物处理癌细胞后其CDH13 mRNA的表达较前明显增强。结论：去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转CDH13基因甲基化状态，从而调控CDH13基因表达。
关键词 5-氮-2’-脱氧胞苷 CDH13基因 食管癌 DNA甲基化
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.06.260
CDH13是钙黏蛋白超家族中的一员，CDH13同时也是一种抑癌基因，具有强大的抗癌作用［1］，它的缺失和肿瘤的发生密切相关［2］。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)是目前最常用且作用最强的一种甲基化抑制剂。本研究应用5-Aza-dC干预培养的人食管癌细胞系OE33，观察干预前后CDH13基因启动子区甲基化状态及表达水平，为食管癌的药物治疗提供理论依据。
资料与方法
材料：①细胞系：OE33用含47.5%RPMI的1640培养基，加入含5%的胎牛血清的47.5%F-12，在37℃，5%CO2的培养液中培养。收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②试剂和仪器：胎牛血清和RPMI培养基购自GIBCO公司，5-aza-2’-deoxycytidine(Sigma公司)，RNA提取试剂及逆转录试剂盒Transzol，基因组DNA提取试剂(takara)，EZ DNA MethylationTM Kit(Zymo research)。
方法：①细胞培养：用含5%胎牛血清的RPMI培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度下孵育培养。将细胞以适宜密度接种，加入含5-Aza-dC的RPMI培养基，使其药物最终浓度5μM，每24小时更换新鲜含药培养基，药物浓度同前，连续作用5天后弃去药液，收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②DNA提取：用DNAiso Reagent抽提细胞株中高纯度基因组DNA。紫外分光光度计测定核酸吸光度(A)值及DNA浓度。③DNA亚硫酸氢盐修饰：按EZ DNA MethylationTM Kit说明书进行操作。最后获得10μl TE缓冲液洗脱修饰好的DNA，-20℃保存。④RNA提取、逆转录：按全式金公司的说明书用Transzol提取细胞RNA。经凝胶电泳后，使用紫外分光光度仪检测提取的总RNA的质量和浓度，要求A260/A280≥2.0，并计算RNA含量。cDNA的合成反应体系20μl。取Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，每一标本取总RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10μl，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μl，用不含RNAase的水不足至总体积20μl。42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟失活TransScript。⑤引物设计和合成：CDH13上游引物：5’-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3’；下游引物：5’-GTGCATGGACGAACAGAGT-3’［3］。GAPDH基因上游引物：5’-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3’；下游引物：5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’［4］。⑥PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，共40个循环；72℃延伸5分钟。RT-PCR产物经2%琼脂糖胶分离。
统计学处理：用药前后比较采用配对t检验。Pearson统计方法分析基因甲基化与其表达之间的相关性，采用SPSS17.0统计软件包进行处理，P≤0.05为差异有统计学意义。
结 果
5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13基因启动子甲基化状态改变：MSP法检测用药前后CDH13基因启动子甲基化状态，干预前OE33细胞呈甲基化状态，干预后去甲基化，见图1。
5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13mRNA表达水平：RT-PCR检测用药前后CDH13mRNA水平，干预前OE33mRNA水平低下，干预后mRNA水平明显升高，结果见图2。
讨 论
本研究观察了甲基化抑制剂5-Aza-dC对食管癌细胞系OE33中CDH13基因甲基化的影响。研究显示，OE33中CDH13启动子区存在超甲基化，用甲基化抑制剂5-Aza-dC干预后，OE33中CDH13启动子区甲基化被逆转，CDH13基因mRNA的表达水平增加。
特定基因的甲基化可能增加癌症的恶性进展［5］。CpG岛超甲基化导致的抑癌基因失活是可以逆转的，利用去甲基化制剂使已经发生甲基化的基因发生去甲基化后可以重新表达，恢复抑癌基因的功能，可能为临床治疗肿瘤提供新的手段。甲基转移酶DNMT的作用是催化DNA甲基化，在CpG岛异常甲基化的肿瘤细胞中多呈过表达，该酶已成为DNA去甲基化，恢复抑癌基因功能的靶分子之一［6］。用DNMT抑制剂5-Aza-dC处理食管癌细胞后，用RT-PCR方法检测处理前后CDH13mRNA表达水平，结果表明，5-Aza-dC处理启动子已经发生高度甲基化且CDH13呈低表达或者表达缺失的食管癌细胞OE33后，CDH13的表达水平明显提高。上述结果具有很好的关联性。这提示在CDH13表达缺失的食管癌癌细胞中，CDH13启动子区的甲基化可能导致了CDH13的表达失活。DNA异常甲基化往往出现在肿瘤的早期，这将为肿瘤的早期诊断提供一定的依据［7］。去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转CDH13基因的甲基化状态，激活CDH13基因表达，CDH13基因可能成为食管癌的一个新靶点；5-Aza-dC有可能用于食管癌的临床治疗，为食管癌患者的诊断和治疗提供了一个新途径。
参考文献
1 Sato M.et al.The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer.Human Genetics,1998,103(1):96-101.
2 Zhong Y,et al.Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity.Clinical Cancer Research,2001,7(6):1683-1687.
3 Sato M,et al.The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer.Hum Genet,1998,103(1):96-101.
4 Mollerup S,et al.Sex differences in lung CYP1A1 expression and DNA adduct levels among lung cancer patients.Cancer Res,1999,59(14):3317-20.
5 Jin Z,et al.Hypermethylation of the nel-like 1 gene is a common and early event and is associated with poor prognosis in early-stage esophageal adenocarcinoma.Oncogene,2007,26(43):6332-6340.
6 Ghoshal K.and S Bai,DNA methyltransferases as targets for cancer therapy.Drugs Today(Barc),2007,43(6):395-422.
7 Esteller M.DNA methylation and cancer therapy:new developments and expectations.Curr Opin Oncol,2005,17(1):55-60.
关键词 5-氮-2’-脱氧胞苷 CDH13基因 食管癌 DNA甲基化
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.06.260
CDH13是钙黏蛋白超家族中的一员，CDH13同时也是一种抑癌基因，具有强大的抗癌作用［1］，它的缺失和肿瘤的发生密切相关［2］。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)是目前最常用且作用最强的一种甲基化抑制剂。本研究应用5-Aza-dC干预培养的人食管癌细胞系OE33，观察干预前后CDH13基因启动子区甲基化状态及表达水平，为食管癌的药物治疗提供理论依据。
资料与方法
材料：①细胞系：OE33用含47.5%RPMI的1640培养基，加入含5%的胎牛血清的47.5%F-12，在37℃，5%CO2的培养液中培养。收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②试剂和仪器：胎牛血清和RPMI培养基购自GIBCO公司，5-aza-2’-deoxycytidine(Sigma公司)，RNA提取试剂及逆转录试剂盒Transzol，基因组DNA提取试剂(takara)，EZ DNA MethylationTM Kit(Zymo research)。
方法：①细胞培养：用含5%胎牛血清的RPMI培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度下孵育培养。将细胞以适宜密度接种，加入含5-Aza-dC的RPMI培养基，使其药物最终浓度5μM，每24小时更换新鲜含药培养基，药物浓度同前，连续作用5天后弃去药液，收取细胞进行实验，以未加药物的细胞株作为对照。②DNA提取：用DNAiso Reagent抽提细胞株中高纯度基因组DNA。紫外分光光度计测定核酸吸光度(A)值及DNA浓度。③DNA亚硫酸氢盐修饰：按EZ DNA MethylationTM Kit说明书进行操作。最后获得10μl TE缓冲液洗脱修饰好的DNA，-20℃保存。④RNA提取、逆转录：按全式金公司的说明书用Transzol提取细胞RNA。经凝胶电泳后，使用紫外分光光度仪检测提取的总RNA的质量和浓度，要求A260/A280≥2.0，并计算RNA含量。cDNA的合成反应体系20μl。取Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，每一标本取总RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10μl，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1μl，用不含RNAase的水不足至总体积20μl。42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟失活TransScript。⑤引物设计和合成：CDH13上游引物：5’-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3’；下游引物：5’-GTGCATGGACGAACAGAGT-3’［3］。GAPDH基因上游引物：5’-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3’；下游引物：5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’［4］。⑥PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸30秒，共40个循环；72℃延伸5分钟。RT-PCR产物经2%琼脂糖胶分离。
统计学处理：用药前后比较采用配对t检验。Pearson统计方法分析基因甲基化与其表达之间的相关性，采用SPSS17.0统计软件包进行处理，P≤0.05为差异有统计学意义。
结 果
5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13基因启动子甲基化状态改变：MSP法检测用药前后CDH13基因启动子甲基化状态，干预前OE33细胞呈甲基化状态，干预后去甲基化，见图1。
5-Aza-dC作用前后人食管腺癌OE33细胞CDH13mRNA表达水平：RT-PCR检测用药前后CDH13mRNA水平，干预前OE33mRNA水平低下，干预后mRNA水平明显升高，结果见图2。
讨 论
本研究观察了甲基化抑制剂5-Aza-dC对食管癌细胞系OE33中CDH13基因甲基化的影响。研究显示，OE33中CDH13启动子区存在超甲基化，用甲基化抑制剂5-Aza-dC干预后，OE33中CDH13启动子区甲基化被逆转，CDH13基因mRNA的表达水平增加。
特定基因的甲基化可能增加癌症的恶性进展［5］。CpG岛超甲基化导致的抑癌基因失活是可以逆转的，利用去甲基化制剂使已经发生甲基化的基因发生去甲基化后可以重新表达，恢复抑癌基因的功能，可能为临床治疗肿瘤提供新的手段。甲基转移酶DNMT的作用是催化DNA甲基化，在CpG岛异常甲基化的肿瘤细胞中多呈过表达，该酶已成为DNA去甲基化，恢复抑癌基因功能的靶分子之一［6］。用DNMT抑制剂5-Aza-dC处理食管癌细胞后，用RT-PCR方法检测处理前后CDH13mRNA表达水平，结果表明，5-Aza-dC处理启动子已经发生高度甲基化且CDH13呈低表达或者表达缺失的食管癌细胞OE33后，CDH13的表达水平明显提高。上述结果具有很好的关联性。这提示在CDH13表达缺失的食管癌癌细胞中，CDH13启动子区的甲基化可能导致了CDH13的表达失活。DNA异常甲基化往往出现在肿瘤的早期，这将为肿瘤的早期诊断提供一定的依据［7］。去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转CDH13基因的甲基化状态，激活CDH13基因表达，CDH13基因可能成为食管癌的一个新靶点；5-Aza-dC有可能用于食管癌的临床治疗，为食管癌患者的诊断和治疗提供了一个新途径。
参考文献
1 Sato M.et al.The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer.Human Genetics,1998,103(1):96-101.
2 Zhong Y,et al.Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity.Clinical Cancer Research,2001,7(6):1683-1687.
3 Sato M,et al.The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer.Hum Genet,1998,103(1):96-101.
4 Mollerup S,et al.Sex differences in lung CYP1A1 expression and DNA adduct levels among lung cancer patients.Cancer Res,1999,59(14):3317-20.
5 Jin Z,et al.Hypermethylation of the nel-like 1 gene is a common and early event and is associated with poor prognosis in early-stage esophageal adenocarcinoma.Oncogene,2007,26(43):6332-6340.
6 Ghoshal K.and S Bai,DNA methyltransferases as targets for cancer therapy.Drugs Today(Barc),2007,43(6):395-422.
7 Esteller M.DNA methylation and cancer therapy:new developments and expectations.Curr Opin Oncol,2005,17(1):55-60.