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摘要 {目的]筛选出能高效降解氨氮或总氮的菌株。{方法]以北京市南宫堆肥厂的垃圾渗滤液为材料，并从中筛选出一株具有高效降解氨氮能力的菌株，通过形态观察、革兰氏染色和16SrDNA分子鉴定等方法对其进行种属的鉴定，且对该菌株降解氨氮最适条件进行研究。{结果]通过鉴定发现该菌株属于弗式柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii），命名为弗式柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii）H-1，简称H-1。该菌株在实验室条件下对氨氮的去除最适的pH为7，最适的氨氮浓度为500mg/L，最适的C/N为8∶1，最适的接种量为1%，最适的C源为红糖∶柠檬酸钠（4∶1）组合的复合C源，在最适的条件下，其对氨氮的降解率为82.5%。{结论]该菌株对处理含有高浓度氨氮的污水具有潜在的应用价值，为环保工作者开发污水中氨氮的高效处理提供理论依据和技术支持。
关键词 氨氮降解菌;渗滤液;筛选鉴定;降解特性
中图分类号X 172文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）36-0053-04
伴随着经济的发展和人们生活水平的提高，垃圾的产量也逐年增高，2015年垃圾产生量已经达790.33万t{1]。在多数发展和发展中国家，处理垃圾的主要手段是垃圾填埋{2]，垃圾在填埋的过程中，由于自身发酵产水、雨水冲淋、地表和地下水浸泡等会产生大量的垃圾渗滤液。垃圾渗滤液是一种高浓度的有机废水，具有水质复杂，有机物、氨氮、TN和COD含量高等特点。这些垃圾渗滤液如果不加以处理，不仅会污染地下水源{3]，还会污染周边的环境，进而对人畜造成威胁。
垃圾渗滤液的主要污染物之一氨氮，因为其性质稳定，不易被物理化学的方法彻底去除，因此多采用生化工艺，通过微生物的硝化和反硝化作用，将其去除。近年来，人们陆续筛选出能降解氨氮的微生物，细菌有假单胞菌属（Pseudomonassp.）{4-5]、粪产碱菌属（Alcaligenesfaecalis）{6]、芽孢杆菌属（Bacillussp.）{7-8]、不动杆菌属（Acinetobactersp.）{9-10]、红球菌属（Rhodococcussp.）{11]、副球菌属（Paracoccus）{12]、苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）{13]、普罗维登斯菌（Providencia）{14]等，真菌有酵母菌属{15-17]、镰刀菌属{18-19]、青霉菌属{19]等。笔者从垃圾渗滤液中分离筛选出了一株具有降解高氨氮能力的菌株，并对其进行了种属的初步鉴定，且对该菌株降解氨氮最适条件进行了研究，旨在为处理高浓度氨氮废水奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源。该试验筛选出的氨氮降解菌株所用的渗滤液来源于北京市南宫堆肥厂。
1.1.2培养基。
1.2方法
1.2.1菌株的分离纯化和筛选。
取渗滤液5mL，加入到灭菌后的100mL富集培养基中，恒温振荡培养（30℃，180r/min），连续富集5d，5d后以1%的比例转接到新的富集培养基中，继续富集5d。富集之后，用稀释涂布平板法以10-3、10-4、10-53个梯度分别涂布于分离培养基，30℃倒置培养。用接种针挑出所有单菌落，以三线法在分离培养基上纯化4～5次，直至纯化出单一菌落，对所纯化出的所有单菌落进行编号，并进行氨氮降解的初步筛选，把氨氮去除效率高的单菌落保存于-80℃超低温冰箱中，备用。
1.2.2菌株的形态特征及分子鉴定。
把超低温冰箱保存的编号为H-1的菌株接种到筛选培养基中培养24h，以其菌液为模版用细菌扩增的通用引物27f和1492r扩增其16srDNA序列，扩增之后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目標条带大小约1500bp，将扩增成功的PCR产物送到北京博迈德基因技术公司测序，测序结果出来之后在NCBI上进行序列比对，并用MEGA5.0做相似性分析，构建菌株H-1的分子发育树。引物由北京博迈德基因技术公司合成，序列如下：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为模板（菌液）0.5μL，PCRmix10.0μL，引物各0.5μL，水13.5μL;PCR反应条件为94℃、5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，72℃、10min，4℃冷却，35个循环。
1.2.3H-1菌株降解氨氮最适条件研究。
研究氨氮初始浓度、可利用C源、C/N比、pH、接种量等条件下H-1菌株对氨氮转化的影响。具体操作如下：用接种环挑取H-1单菌落接种到装有100mL筛选培养基中，置于28℃、180r/min摇床中培养，每24h取菌液检测其氨氮浓度，连续检测5d，计算氨氮降解率。每一条件均设2个对照，3个平行样，自然pH为6.8。除最适氨氮浓度试验外，其他条件下氨氮初始浓度均为500mg/L;除pH试验外，其他试验pH均为6.8;除C/N试验外，其他条件下C/N均为8∶1;除可利用C源试验和接种量试验外，其他试验C源均为柠檬酸三钠。氨氮初始浓度分别设500、750、1000、1250、1500mg/L;pH分别设5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;C/N分别设8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1;可利用C源试验分别设红糖、柠檬酸三钠、葡萄糖、蔗糖、红糖/柠檬酸三钠（4∶1）;接种量（菌液）分别设1%、3%、5%、7%、9%，C源为红糖/柠檬酸三钠（4∶1）。
2结果与分析
2.1菌株的形态特征及分子鉴定
2.1.1菌株的形态特征。H-1菌株在分离平板上培养24h可观察到其凸起生长，菌体白色，湿润，边缘平滑无刺，突起生长，正反面颜色相同，继续培养24h，可观察到菌落表面微泛黄。在显微镜下观察菌体细胞短杆状，革兰氏染色阴性（图1）。 2.2H-1菌株降解氨氮最适条件研究
2.2.1最适氨氮初始浓度试验。
不同的氨氧化菌对氨氮浓度的耐受程度不同，2006年Kim等{20]和Joo等{21]的研究均表明，高浓度氨氮会抑制氨氮降解菌及其他细菌的生长，影响氨氧化菌的活性，进而影响微生物对氨氮的去除，因此筛选出具有高效氨氮耐受性的菌株对实际应用具有重要的意义。
由图3可知，硫酸铵作为培养基中唯一的氮源，红糖作为唯一的C源，在氨氮初始浓度分别为500、750、1000、1250、1500mg/L时，氨氮在第5天时的降解率分别是73.23%、57.17%、51.61%、45.47%和39.51%。表明氨氮初始浓度在500～1500mg/L时，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮降解率虽然不断下降，但其降解速率逐渐增高，说明高浓度的氨氮并未抑制该菌株对氨氮的降解，菌株的这种氨氮去除特性在实际工程应用中具有较强的潜力。
2.2.2最适C/N试验。
C/N是直接影响微生物的生长代谢和产物积累的重要因子之一，Taylor等{14]研究不同C/N对ProvidenciarettgariYL生长代谢和氨氮去除的影响发现，C/N为10时，氨氮的去除与C源的消耗达到最佳的平衡状态。因此合适的C/N对微生物的生长代谢及氨氮的去除效率都具有重要意义，该试验在富集和初筛时选用的C/N均为8∶1，以此为基础逐渐增加C/N至12∶1，以期选出最适的C/N，以优化该菌株对氨氮的降解能力。
从图4可以看出，当碳源为柠檬酸钠，硫酸铵为唯一N源时，氨氮初始浓度为500mg/L时，C/N在8∶1～12∶1时H-1菌株对氨氮的降解效率几乎沒有影响。推测可能该菌株对C源浓度需求不敏感，或者是C/N梯度设计距离较小，没有把C/N的差距拉开的原因。
2.2.3最适pH试验。每种微生物都有其自身最适生长的pH，pH过高过低都会影响其生长代谢，进而影响微生物对氨氮的去除能力。由图5可知，当pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时，其对氨氮的去除率分别为60.51%、66.6%、74.02%、66.84%、62.28%，该菌在pH为7.0的条件下，其降解率最高，但是当pH仅仅下降至6.5或升高至7.5时，其降解率明显下降，表明该菌株对pH的要求相对比较严格。
2.2.4可利用C源试验。
微生物生命活动所需的能量及其细胞的碳架都需要碳源。合适的碳源能促进微生物的生长和代谢，进而提高微生物对氨氮降解的能力。从图6可以看出，该菌对柠檬酸钠、红糖、蔗糖、葡萄糖作为C源均能利用。当C源为柠檬酸钠时，其氨氮降解率最高，为72.94%;其次是红糖，为65.87%;葡萄糖的利用稍差，其降解率仅55.95%;但当C源为红糖/柠檬酸钠（4∶1）组合的复合C源时，在其他条件不变的情况下，其氨氮降解率提高至80.02%。因此，菌株H-1对降解氨氮最适的C源是红糖/柠檬酸钠（4∶1）复合C源。
2.2.5最适接种量试验。
接种量决定了菌株的繁殖速度，从图7可以看出，硫酸铵作为培养基中唯一的氮源，柠檬酸钠作为唯一的C源时，当初始氨氮浓度不变时，在接种48h内，接种量在5%～9%时对氨氮的去除率要稍高于接种量为1%～3%，但是当64h后检测发现，接种量在1%～3%其对氨氮的去除率反而要高于接种量为5%～9%。因此菌株H-1降解氨氮最适的接种量为1%～3%。
3结论与讨论
该试验从北京市南宫垃圾堆肥厂垃圾渗滤液中筛选出了一株降解氨氮的菌株，分子鉴定结果表明其属于弗式柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii）属。
菌株H-1降解氨氮最适条件的研究表明，虽然当氨氮初始浓度为500mg/L时，其降解率最高，达73.23%，但是当氨氮初始浓度在500～1500mg/L时，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮降解率不断下降，其降解速率逐渐增高，说明高浓度的氨氮并未抑制该菌株对氨氮的降解，这与刘志云等{15-16]的研究结果类似。刘志云等在研究粉状毕赤酵母NGH在不同初始氨氮浓度耐受性试验时表明，当初始浓度分别为111.19、356.02、645.49、1233.47mg/L时，菌株NGH在24h内的氨氮降解率呈现下降趋势，氨氮降解速率却呈现上升趋势;研究克柔假丝酵母LSA时也发现，当氨氮初始浓度为100、300、600、1200mg/L时，菌株LSA在接种后24h内的氨氮降解率呈现下降趋势，氨氮降解速率呈现上升趋势。刘志云等认为菌株的这种氨氮去除特性在实际工程应用中具有很大的潜力。当C/N在8∶1～12∶1时，菌株H-1对氨氮的降解效率几乎没有影响。李明堂等{9]在研究耐冷约氏不动杆菌DBP-3时发现，C/N从8增加至10时，氨氮的去除率并没有明显增加，但是当C/N从4增加至8时，菌株DBP-3对氨氮的去除率随着C/N的增加而明显增加。Kim等{20]将多株芽孢杆菌属的细菌在不同条件下进行混合培养，发现其氨氮去除率在C/N为8时明显高于C/N为4时。因此菌株H-1在C/N为8∶1～12∶1时对氨氮的降解效率没有影响，可能是C/N为8∶1～12∶1时都达到了氨氮的去除与C源的消耗互相平衡的状态，而考虑到实际生产中的成本问题，菌株H-1降解氨氮最适的C/N选为8∶1。菌株对pH要求相对严格，其最适的pH为7.0。在已有的报道中，王涛等{8]从土壤中分离出的一株枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）N9，其最适pH也为7.0，而朱伟等{4]从生活污水处理污泥中筛选出的一株假单胞菌（Pseudomonas）DX3最适的pH为7.5，喻其林等{22]从鸡粪好氧堆肥分离出的一株氨氧化青霉（Penicilliumsp.）M25-22，其最适pH为8.0，这与微生物生存的环境有关，在不同环境中筛选的菌种是有一定差异的。菌株H-1降解氨氮最适的C源是红糖/柠檬酸钠（4∶1）复合C源。菌株H-1降解氨氮最适的接种量为1%～3%。在最适的条件下，当初始氨氮浓度为500mg/L，其对氨氮的最高降解率为82.5%。 参考文献
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关键词 氨氮降解菌;渗滤液;筛选鉴定;降解特性
中图分类号X 172文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）36-0053-04
伴随着经济的发展和人们生活水平的提高，垃圾的产量也逐年增高，2015年垃圾产生量已经达790.33万t{1]。在多数发展和发展中国家，处理垃圾的主要手段是垃圾填埋{2]，垃圾在填埋的过程中，由于自身发酵产水、雨水冲淋、地表和地下水浸泡等会产生大量的垃圾渗滤液。垃圾渗滤液是一种高浓度的有机废水，具有水质复杂，有机物、氨氮、TN和COD含量高等特点。这些垃圾渗滤液如果不加以处理，不仅会污染地下水源{3]，还会污染周边的环境，进而对人畜造成威胁。
垃圾渗滤液的主要污染物之一氨氮，因为其性质稳定，不易被物理化学的方法彻底去除，因此多采用生化工艺，通过微生物的硝化和反硝化作用，将其去除。近年来，人们陆续筛选出能降解氨氮的微生物，细菌有假单胞菌属（Pseudomonassp.）{4-5]、粪产碱菌属（Alcaligenesfaecalis）{6]、芽孢杆菌属（Bacillussp.）{7-8]、不动杆菌属（Acinetobactersp.）{9-10]、红球菌属（Rhodococcussp.）{11]、副球菌属（Paracoccus）{12]、苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）{13]、普罗维登斯菌（Providencia）{14]等，真菌有酵母菌属{15-17]、镰刀菌属{18-19]、青霉菌属{19]等。笔者从垃圾渗滤液中分离筛选出了一株具有降解高氨氮能力的菌株，并对其进行了种属的初步鉴定，且对该菌株降解氨氮最适条件进行了研究，旨在为处理高浓度氨氮废水奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源。该试验筛选出的氨氮降解菌株所用的渗滤液来源于北京市南宫堆肥厂。
1.1.2培养基。
1.2方法
1.2.1菌株的分离纯化和筛选。
取渗滤液5mL，加入到灭菌后的100mL富集培养基中，恒温振荡培养（30℃，180r/min），连续富集5d，5d后以1%的比例转接到新的富集培养基中，继续富集5d。富集之后，用稀释涂布平板法以10-3、10-4、10-53个梯度分别涂布于分离培养基，30℃倒置培养。用接种针挑出所有单菌落，以三线法在分离培养基上纯化4～5次，直至纯化出单一菌落，对所纯化出的所有单菌落进行编号，并进行氨氮降解的初步筛选，把氨氮去除效率高的单菌落保存于-80℃超低温冰箱中，备用。
1.2.2菌株的形态特征及分子鉴定。
把超低温冰箱保存的编号为H-1的菌株接种到筛选培养基中培养24h，以其菌液为模版用细菌扩增的通用引物27f和1492r扩增其16srDNA序列，扩增之后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目標条带大小约1500bp，将扩增成功的PCR产物送到北京博迈德基因技术公司测序，测序结果出来之后在NCBI上进行序列比对，并用MEGA5.0做相似性分析，构建菌株H-1的分子发育树。引物由北京博迈德基因技术公司合成，序列如下：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为模板（菌液）0.5μL，PCRmix10.0μL，引物各0.5μL，水13.5μL;PCR反应条件为94℃、5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，72℃、10min，4℃冷却，35个循环。
1.2.3H-1菌株降解氨氮最适条件研究。
研究氨氮初始浓度、可利用C源、C/N比、pH、接种量等条件下H-1菌株对氨氮转化的影响。具体操作如下：用接种环挑取H-1单菌落接种到装有100mL筛选培养基中，置于28℃、180r/min摇床中培养，每24h取菌液检测其氨氮浓度，连续检测5d，计算氨氮降解率。每一条件均设2个对照，3个平行样，自然pH为6.8。除最适氨氮浓度试验外，其他条件下氨氮初始浓度均为500mg/L;除pH试验外，其他试验pH均为6.8;除C/N试验外，其他条件下C/N均为8∶1;除可利用C源试验和接种量试验外，其他试验C源均为柠檬酸三钠。氨氮初始浓度分别设500、750、1000、1250、1500mg/L;pH分别设5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;C/N分别设8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1;可利用C源试验分别设红糖、柠檬酸三钠、葡萄糖、蔗糖、红糖/柠檬酸三钠（4∶1）;接种量（菌液）分别设1%、3%、5%、7%、9%，C源为红糖/柠檬酸三钠（4∶1）。
2结果与分析
2.1菌株的形态特征及分子鉴定
2.1.1菌株的形态特征。H-1菌株在分离平板上培养24h可观察到其凸起生长，菌体白色，湿润，边缘平滑无刺，突起生长，正反面颜色相同，继续培养24h，可观察到菌落表面微泛黄。在显微镜下观察菌体细胞短杆状，革兰氏染色阴性（图1）。 2.2H-1菌株降解氨氮最适条件研究
2.2.1最适氨氮初始浓度试验。
不同的氨氧化菌对氨氮浓度的耐受程度不同，2006年Kim等{20]和Joo等{21]的研究均表明，高浓度氨氮会抑制氨氮降解菌及其他细菌的生长，影响氨氧化菌的活性，进而影响微生物对氨氮的去除，因此筛选出具有高效氨氮耐受性的菌株对实际应用具有重要的意义。
由图3可知，硫酸铵作为培养基中唯一的氮源，红糖作为唯一的C源，在氨氮初始浓度分别为500、750、1000、1250、1500mg/L时，氨氮在第5天时的降解率分别是73.23%、57.17%、51.61%、45.47%和39.51%。表明氨氮初始浓度在500～1500mg/L时，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮降解率虽然不断下降，但其降解速率逐渐增高，说明高浓度的氨氮并未抑制该菌株对氨氮的降解，菌株的这种氨氮去除特性在实际工程应用中具有较强的潜力。
2.2.2最适C/N试验。
C/N是直接影响微生物的生长代谢和产物积累的重要因子之一，Taylor等{14]研究不同C/N对ProvidenciarettgariYL生长代谢和氨氮去除的影响发现，C/N为10时，氨氮的去除与C源的消耗达到最佳的平衡状态。因此合适的C/N对微生物的生长代谢及氨氮的去除效率都具有重要意义，该试验在富集和初筛时选用的C/N均为8∶1，以此为基础逐渐增加C/N至12∶1，以期选出最适的C/N，以优化该菌株对氨氮的降解能力。
从图4可以看出，当碳源为柠檬酸钠，硫酸铵为唯一N源时，氨氮初始浓度为500mg/L时，C/N在8∶1～12∶1时H-1菌株对氨氮的降解效率几乎沒有影响。推测可能该菌株对C源浓度需求不敏感，或者是C/N梯度设计距离较小，没有把C/N的差距拉开的原因。
2.2.3最适pH试验。每种微生物都有其自身最适生长的pH，pH过高过低都会影响其生长代谢，进而影响微生物对氨氮的去除能力。由图5可知，当pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时，其对氨氮的去除率分别为60.51%、66.6%、74.02%、66.84%、62.28%，该菌在pH为7.0的条件下，其降解率最高，但是当pH仅仅下降至6.5或升高至7.5时，其降解率明显下降，表明该菌株对pH的要求相对比较严格。
2.2.4可利用C源试验。
微生物生命活动所需的能量及其细胞的碳架都需要碳源。合适的碳源能促进微生物的生长和代谢，进而提高微生物对氨氮降解的能力。从图6可以看出，该菌对柠檬酸钠、红糖、蔗糖、葡萄糖作为C源均能利用。当C源为柠檬酸钠时，其氨氮降解率最高，为72.94%;其次是红糖，为65.87%;葡萄糖的利用稍差，其降解率仅55.95%;但当C源为红糖/柠檬酸钠（4∶1）组合的复合C源时，在其他条件不变的情况下，其氨氮降解率提高至80.02%。因此，菌株H-1对降解氨氮最适的C源是红糖/柠檬酸钠（4∶1）复合C源。
2.2.5最适接种量试验。
接种量决定了菌株的繁殖速度，从图7可以看出，硫酸铵作为培养基中唯一的氮源，柠檬酸钠作为唯一的C源时，当初始氨氮浓度不变时，在接种48h内，接种量在5%～9%时对氨氮的去除率要稍高于接种量为1%～3%，但是当64h后检测发现，接种量在1%～3%其对氨氮的去除率反而要高于接种量为5%～9%。因此菌株H-1降解氨氮最适的接种量为1%～3%。
3结论与讨论
该试验从北京市南宫垃圾堆肥厂垃圾渗滤液中筛选出了一株降解氨氮的菌株，分子鉴定结果表明其属于弗式柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii）属。
菌株H-1降解氨氮最适条件的研究表明，虽然当氨氮初始浓度为500mg/L时，其降解率最高，达73.23%，但是当氨氮初始浓度在500～1500mg/L时，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮降解率不断下降，其降解速率逐渐增高，说明高浓度的氨氮并未抑制该菌株对氨氮的降解，这与刘志云等{15-16]的研究结果类似。刘志云等在研究粉状毕赤酵母NGH在不同初始氨氮浓度耐受性试验时表明，当初始浓度分别为111.19、356.02、645.49、1233.47mg/L时，菌株NGH在24h内的氨氮降解率呈现下降趋势，氨氮降解速率却呈现上升趋势;研究克柔假丝酵母LSA时也发现，当氨氮初始浓度为100、300、600、1200mg/L时，菌株LSA在接种后24h内的氨氮降解率呈现下降趋势，氨氮降解速率呈现上升趋势。刘志云等认为菌株的这种氨氮去除特性在实际工程应用中具有很大的潜力。当C/N在8∶1～12∶1时，菌株H-1对氨氮的降解效率几乎没有影响。李明堂等{9]在研究耐冷约氏不动杆菌DBP-3时发现，C/N从8增加至10时，氨氮的去除率并没有明显增加，但是当C/N从4增加至8时，菌株DBP-3对氨氮的去除率随着C/N的增加而明显增加。Kim等{20]将多株芽孢杆菌属的细菌在不同条件下进行混合培养，发现其氨氮去除率在C/N为8时明显高于C/N为4时。因此菌株H-1在C/N为8∶1～12∶1时对氨氮的降解效率没有影响，可能是C/N为8∶1～12∶1时都达到了氨氮的去除与C源的消耗互相平衡的状态，而考虑到实际生产中的成本问题，菌株H-1降解氨氮最适的C/N选为8∶1。菌株对pH要求相对严格，其最适的pH为7.0。在已有的报道中，王涛等{8]从土壤中分离出的一株枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）N9，其最适pH也为7.0，而朱伟等{4]从生活污水处理污泥中筛选出的一株假单胞菌（Pseudomonas）DX3最适的pH为7.5，喻其林等{22]从鸡粪好氧堆肥分离出的一株氨氧化青霉（Penicilliumsp.）M25-22，其最适pH为8.0，这与微生物生存的环境有关，在不同环境中筛选的菌种是有一定差异的。菌株H-1降解氨氮最适的C源是红糖/柠檬酸钠（4∶1）复合C源。菌株H-1降解氨氮最适的接种量为1%～3%。在最适的条件下，当初始氨氮浓度为500mg/L，其对氨氮的最高降解率为82.5%。 参考文献
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