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摘要：根结线虫病是一种重要的烟草土传病害，在局部烟区发生严重，造成过巨大经济损失。采集受根结线虫危害的植烟区土壤，分离出线虫后，利用已有菌种库资源，通过室内菌株发酵液灭杀线虫活性试验，筛选出了4株具有防治根结线虫的生防菌株，菌株发酵液原液室内杀线效果良好，均达到80%以上，随着稀释倍数增加灭杀活性不断降低，320倍时灭杀活性完全丧失。将筛选出的功能菌与腐熟的万寿菊秸秆有机肥复配后形成功能型生物有机肥，在植烟区通过田间小区试验验证其功能，结果表明，施用功能型生物有机肥后，能够促进烟株的早生快发，在后期能够促进叶片开片，改善烤烟农艺性状，但根结线虫危害情况并无改善，说明在根结线虫危害极为严重的地块，生防功能有机肥对根结线虫的防治效果有限。
关键词：烟草;根结线虫;生防菌株;万寿菊秸秆;农艺性状
烟草（Nicotiana tabacum L.）是茄科烟草属，一年生或有限多年生草本植物，原产于南美洲。目前在我国云南、贵州等地大面积种植，是我国重要的经济作物之一，其成熟叶片主要用于卷烟生产，具有极高的经济价值。因此在烤烟生产过程中，提高烟叶产量和品质极为重要，而烟草病害是影响烟叶产量和品质的重要因素[1-3]。
其中，根结线虫病是烟草种植的主要病害之一，严重影响烟草的高质高产[4-5]，在我国各大烟草种植区均有发生，且危害严重，每年因根结线虫危害造成的损失巨大。据统计，全国根结线虫直接危害所造成的烟叶经济损失占侵染性病害造成损失的5.7%[6]，严重制约烟叶的生产发展。但是由于该病侵染的特殊性、为害的隐蔽性而对防治工作造成了极大的困扰[7]。并且受环境和经济水平所限，我国大部分缺水旱作烟区无法开展水旱轮作，因此多采用化学手段防治[8-10]，虽取得了一些成效，但因其选择性差、高残留和不易降解，也造成了烟叶农药残留增加、农作物生态环境被破坏、烟叶品质下降、环境污染加重、抗药性问题日益突出等后果[11-13]。
随着国家烟草专卖局提倡绿色防控理念，减少化学农药使用，采用微生物菌剂或其他绿色防控措施替代化学农药，已经成为烟草病虫害防控的主要思路。因此，筛选出具有生防功能的微生物，将其应用到烟草生产中，并评价其针对烟草根结线虫的防控效果，对烟草根结线虫的防控、生态环境的保护以及人们生命健康具有重大意义[14]。
万寿菊别称臭芙蓉，一年生草本花卉，其花朵提取的色素被广泛用于食品、化妆品、烟草、医药及禽类饲料中[15-17]。由于其用途广泛以及具备的经济价值，在曲靖地区大面积种植。万寿菊主要经济器官是花朵，采收后会产生大量秸秆，但由于万寿菊秸秆中木质素、纤维素的含量较高，直接还田难以自然降解，而且含有多种挥发性化学成分，不能作为饲料使用。目前万寿菊秸秆大部分就地焚烧或晒干后作农家燃料，均未能得到有效利用，造成了资源的极大浪费，且对环境造成一定污染[18]。国内多个学者均针对此问题进行研究，并且有研究表明，萬寿菊秸秆提取物对根结线虫具有较好的抑杀作用[19]。
本研究第1阶段利用已有菌种库资源，筛选能够防治烟草根结线虫的生防菌株，探究其对烟草根结线虫的灭杀效果，同时研究具有杀线潜力菌株与完全腐熟万寿菊秸秆有机肥的复配机制。第2阶段采用田间小区试验的方式，开展以万寿菊秸秆为原料开发的生防功能有机肥对烤烟生产和线虫危害的影响研究，通过对施肥前后植烟土壤养分、烟株的田间长势长相和农艺性状、线虫的发生状况、经济性状和烟叶品质等数据的综合分析，客观评价生防功能有机肥在曲靖烟区的应用效果，整个研究对曲靖植烟区烟草根结线虫及土壤保育具有重要意义，并且为后期的推广应用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株为云南省微生物发酵工程研究中心有限公司自主筛选研发的具有杀线作用的生防菌株。
供试根结线虫采自曲靖市沾益区大坡乡植烟区受根结线虫侵染的烟株，烟草品种为云烟97，取受侵染烟株根际土，采用蔗糖离心浮选法分离根结线虫。
供试地为曲靖市沾益区大坡乡。试验时间为2019年5—12月。供试作物为烟草品种（云烟97）。
供试肥料：烟草专用复合肥（氮、P2O5、K2O含量分别为15%、8%、25%）、普通过磷酸钙（P2O5含量≥17%）、硝酸钾（氮、P2O5、K2O含量分别为135%、0%、44.5%）、硫酸钾（K2O含量≥50%）、钙镁磷肥（P2O5含量≥18%）、生防功能有机肥5号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ5），生防功能有机肥9号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ9）、生防功能有机肥11号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ11）、生防功能有机肥12号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ12）。
蔗糖溶液的配制：1 000 mL纯净水 454 g蔗糖（白糖）。
1.2 试验方法
1.2.1 蔗糖离心悬浮法分离根结线虫 按李美芹等的专利中提及的蔗糖离心悬浮法进行根结线虫的分离[20]。分离完成后，取试管下部带有线虫的液体，取1 mL置于培养皿中，于体式显微镜下计数。
1.2.2 具有拮抗烟草根结线虫的功能菌株筛选
1.2.2.1 不同生防菌株对根结线虫灭杀活性测定 将菌种库保存的具有杀线功能的菌株分别接种于Luria-Bertani（LB）液体培养基中进行活化，即37 ℃、180 r/min 培养48 h，后将菌液浓度稀释至 1亿CFU/mL，取1 mL置于48孔细胞培养板中，再加入线虫悬浮液100 μL（约 100头）混匀，25 ℃静置12 h后，于光学显微镜下观察，记录线虫存活情况，计算校正死亡率（僵直不动为死体，弯曲蠕动为活体）。设无菌LB液体培养基及万寿菊秸秆有机肥浸出液处理作为对照，每个处理设置5个重复。 根据以下公式计算线虫的校正致死率：致死率=死亡线虫数/供试线虫数×100%;
校正致死率=（处理致死率-对照致死率）/（1-对照致死率）×100%。
选取上述试验中对线虫校正死亡率在80%以上的菌株分别进行处理时间及处理浓度的测定，即利用其发酵原液分别处理线虫30、60、90、120、150、180 min;利用其发酵原液以及10、20、40、80、160、320、640倍的稀释液分别处理线虫，观察记录线虫的活性情况，计算校正死亡率，每个处理设置5次重复。
1.2.2.2 不同生防菌株在温室大棚内对根结线虫防效的测定 试验于云南省微生物发酵工程研究中心有限公司试验基地温室大棚内进行，将健康且长势一致的烟苗移栽至装有从受危害严重地区（曲靖市沾益区大坡乡）采集的根际土壤的花盆中，制备供试菌株发酵液，在烟苗移栽后3 d，每盆分别灌根300 mL，同时设清水、LB液体培养基、万寿菊秸秆有机肥浸出液3个处理作为对照。90 d后取烟株根系调查病情指数，分级并记录结果，调查方法采用GB/T 23222—2008 《烟草病虫害分级及调查方法》。
1.2.3 功能微生物与完全腐熟的万寿菊秸秆有机肥复配 利用能够防治烟草青枯病的生防菌1号（Q1）、能够防治烟草黑胫病的生防菌2号（Q2）与上述试验中防效较好的菌株分别复配后添加到完全腐熟的万寿菊秸秆有机肥中，添加量为肥料总质量的1%，添加结束后按仓库正常堆贮条件堆放，定期检测各生防功能菌的有效活菌数，同时每天定时检测堆体上、中、下层的温度，连续检测10 d，并记录分析。
1.2.4 植烟地区田间效果验证 试验安排在曲靖市沾益区大坡乡，试验地块往年发病较为严重，试验前对土壤中线虫的虫口密度进行了统计，得出土壤中线虫的虫口密度为56头/100 g。
1.2.4.1 试验设计 试验采用随机区组设计，6个处理，3次重复，共18个小区。
处理1：空白对照，不施用任何有机肥料;处理2：施用万寿菊秸秆有机肥200 g/株;处理3：施用生防功能有机肥5号200 g/株;处理4：施用生防功能有机肥9号200 g/株;处理5：施用生防功能有机肥11号200 g/株;处理6：施用生防功能有机肥12号200 g/株。
每个小区植烟60株，株行距为120 cm×60 cm，植烟13 890株/hm2。每个处理施纯氮97.5 kg/hm2，氮、磷、钾质量比为1 ∶ 1.5 ∶ 3，各处理肥料具体用量详见表1。
施肥方法：烟草专用复合肥、普钙、硫酸钾、万寿菊秸秆有机肥和生防功能有机肥作基肥，其中万寿菊秸秆有机肥和生防功能有机肥在移栽前塘施，烟草专用复合肥、普钙和硫酸钾在移栽时中层环施;硝酸钾作追肥，在移栽后30 d左右兑水浇施。
植烟株数按13 890株/hm2计，单株肥料用量见表2。
1.2.4.2 土壤养分调查 在施肥前取一个基础土样，烤烟采烤后每个处理各取1个土样，合计7个土样（每个土样1 kg），对每个样品的土壤pH值、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾的含量进行检测分析。
1.2.4.3 生育期调查 分别观察记录每个处理50%烟株达到团棵、旺长、现蕾、封顶、采烤等生育期的时间。
1.2.4.4 农艺性状调查 在移栽后50 d和采烤前，每个小区试验选择5株有代表性的烟株测量其株高、茎围、叶片数、最大叶长和最大叶宽等农艺性状。
1.2.4.5 病害发生情况调查 在整个大田生育期对其他主要病害的发生情况以及采烤后取根系调查各处理根结线虫的发生情况及病情指数进行调查分级并记录结果，调查方法采用GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》。
1.2.4.6 产质量调查统计 每个处理单独挂牌烘烤，依据GB 2635—1992《烤烟》中42级国家烤煙分级标准分级，并统计产量和产值。各处理分别选取X2F、C3F、B2F（X2F表示下部叶橘黄色2级烟、C3F表示中部叶橘黄色3级烟、B2F表示上部叶橘黄色2级烟）各1 kg统一送检，进行烟叶内在化学成分分析。
2 结果与分析
2.1 具有拮抗烟草根结线虫的菌株筛选
2.1.1 具有灭杀根结线虫的功能生防菌筛选 由表3可知，利用试验前期筛选得到的对线虫具有灭杀活性的7株生防菌再次进行烟草根结线虫灭杀活性的筛选发现，各菌株发酵液均有灭杀活性，其中5、9、11、12号菌对线虫的校正致死率都在80%以上，分别达81.12%、84.28%、85.91%、82.36%，后续试验将选取以上4个菌株进一步开展。
2.1.2 不同稀释倍数发酵液对线虫活性的影响 由图1可知，不同稀释倍数发酵液对根结线虫的校正死亡率随着发酵倍数的增加而降低。稀释40倍后，各生防功能菌的抑杀活性大幅降低，稀释160倍后，生防菌的校正致死率均低于10%，稀释320倍后，各生防菌已基本丧失抑杀活性。
2.1.3 不同处理时间发酵液对线虫活性的影响 由图2可知，随着各菌株发酵液对线虫的处理时间增长，对线虫的抑杀活性越强，处理时间为2 h时，9号、11号菌株发酵液校正死亡率大幅高于5号、12号菌株发酵液，且较为相近，分别为81.69%和8159%;处理时间为3 h时，9号、11号菌株发酵液依然极为相近，且均高于其余2株菌株发酵液。整体而言，9号与11号菌株发酵液对线虫抑杀活性较高，且2 h后随着时间的延长抑杀活性增幅较小。
2.1.4 不同生防菌株对根结线虫温室烟草盆栽防效的测定 由表4的生防结果可知，4株生防功能能菌对烟草根结线虫均具有一定的防效，生防功能菌的病情指数均低于对照，生防效果依次为WSWFJ11
关键词：烟草;根结线虫;生防菌株;万寿菊秸秆;农艺性状
烟草（Nicotiana tabacum L.）是茄科烟草属，一年生或有限多年生草本植物，原产于南美洲。目前在我国云南、贵州等地大面积种植，是我国重要的经济作物之一，其成熟叶片主要用于卷烟生产，具有极高的经济价值。因此在烤烟生产过程中，提高烟叶产量和品质极为重要，而烟草病害是影响烟叶产量和品质的重要因素[1-3]。
其中，根结线虫病是烟草种植的主要病害之一，严重影响烟草的高质高产[4-5]，在我国各大烟草种植区均有发生，且危害严重，每年因根结线虫危害造成的损失巨大。据统计，全国根结线虫直接危害所造成的烟叶经济损失占侵染性病害造成损失的5.7%[6]，严重制约烟叶的生产发展。但是由于该病侵染的特殊性、为害的隐蔽性而对防治工作造成了极大的困扰[7]。并且受环境和经济水平所限，我国大部分缺水旱作烟区无法开展水旱轮作，因此多采用化学手段防治[8-10]，虽取得了一些成效，但因其选择性差、高残留和不易降解，也造成了烟叶农药残留增加、农作物生态环境被破坏、烟叶品质下降、环境污染加重、抗药性问题日益突出等后果[11-13]。
随着国家烟草专卖局提倡绿色防控理念，减少化学农药使用，采用微生物菌剂或其他绿色防控措施替代化学农药，已经成为烟草病虫害防控的主要思路。因此，筛选出具有生防功能的微生物，将其应用到烟草生产中，并评价其针对烟草根结线虫的防控效果，对烟草根结线虫的防控、生态环境的保护以及人们生命健康具有重大意义[14]。
万寿菊别称臭芙蓉，一年生草本花卉，其花朵提取的色素被广泛用于食品、化妆品、烟草、医药及禽类饲料中[15-17]。由于其用途广泛以及具备的经济价值，在曲靖地区大面积种植。万寿菊主要经济器官是花朵，采收后会产生大量秸秆，但由于万寿菊秸秆中木质素、纤维素的含量较高，直接还田难以自然降解，而且含有多种挥发性化学成分，不能作为饲料使用。目前万寿菊秸秆大部分就地焚烧或晒干后作农家燃料，均未能得到有效利用，造成了资源的极大浪费，且对环境造成一定污染[18]。国内多个学者均针对此问题进行研究，并且有研究表明，萬寿菊秸秆提取物对根结线虫具有较好的抑杀作用[19]。
本研究第1阶段利用已有菌种库资源，筛选能够防治烟草根结线虫的生防菌株，探究其对烟草根结线虫的灭杀效果，同时研究具有杀线潜力菌株与完全腐熟万寿菊秸秆有机肥的复配机制。第2阶段采用田间小区试验的方式，开展以万寿菊秸秆为原料开发的生防功能有机肥对烤烟生产和线虫危害的影响研究，通过对施肥前后植烟土壤养分、烟株的田间长势长相和农艺性状、线虫的发生状况、经济性状和烟叶品质等数据的综合分析，客观评价生防功能有机肥在曲靖烟区的应用效果，整个研究对曲靖植烟区烟草根结线虫及土壤保育具有重要意义，并且为后期的推广应用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株为云南省微生物发酵工程研究中心有限公司自主筛选研发的具有杀线作用的生防菌株。
供试根结线虫采自曲靖市沾益区大坡乡植烟区受根结线虫侵染的烟株，烟草品种为云烟97，取受侵染烟株根际土，采用蔗糖离心浮选法分离根结线虫。
供试地为曲靖市沾益区大坡乡。试验时间为2019年5—12月。供试作物为烟草品种（云烟97）。
供试肥料：烟草专用复合肥（氮、P2O5、K2O含量分别为15%、8%、25%）、普通过磷酸钙（P2O5含量≥17%）、硝酸钾（氮、P2O5、K2O含量分别为135%、0%、44.5%）、硫酸钾（K2O含量≥50%）、钙镁磷肥（P2O5含量≥18%）、生防功能有机肥5号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ5），生防功能有机肥9号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ9）、生防功能有机肥11号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ11）、生防功能有机肥12号（万寿菊秸秆有机肥中添加功能菌Q1、Q2、WSWFJ12）。
蔗糖溶液的配制：1 000 mL纯净水 454 g蔗糖（白糖）。
1.2 试验方法
1.2.1 蔗糖离心悬浮法分离根结线虫 按李美芹等的专利中提及的蔗糖离心悬浮法进行根结线虫的分离[20]。分离完成后，取试管下部带有线虫的液体，取1 mL置于培养皿中，于体式显微镜下计数。
1.2.2 具有拮抗烟草根结线虫的功能菌株筛选
1.2.2.1 不同生防菌株对根结线虫灭杀活性测定 将菌种库保存的具有杀线功能的菌株分别接种于Luria-Bertani（LB）液体培养基中进行活化，即37 ℃、180 r/min 培养48 h，后将菌液浓度稀释至 1亿CFU/mL，取1 mL置于48孔细胞培养板中，再加入线虫悬浮液100 μL（约 100头）混匀，25 ℃静置12 h后，于光学显微镜下观察，记录线虫存活情况，计算校正死亡率（僵直不动为死体，弯曲蠕动为活体）。设无菌LB液体培养基及万寿菊秸秆有机肥浸出液处理作为对照，每个处理设置5个重复。 根据以下公式计算线虫的校正致死率：致死率=死亡线虫数/供试线虫数×100%;
校正致死率=（处理致死率-对照致死率）/（1-对照致死率）×100%。
选取上述试验中对线虫校正死亡率在80%以上的菌株分别进行处理时间及处理浓度的测定，即利用其发酵原液分别处理线虫30、60、90、120、150、180 min;利用其发酵原液以及10、20、40、80、160、320、640倍的稀释液分别处理线虫，观察记录线虫的活性情况，计算校正死亡率，每个处理设置5次重复。
1.2.2.2 不同生防菌株在温室大棚内对根结线虫防效的测定 试验于云南省微生物发酵工程研究中心有限公司试验基地温室大棚内进行，将健康且长势一致的烟苗移栽至装有从受危害严重地区（曲靖市沾益区大坡乡）采集的根际土壤的花盆中，制备供试菌株发酵液，在烟苗移栽后3 d，每盆分别灌根300 mL，同时设清水、LB液体培养基、万寿菊秸秆有机肥浸出液3个处理作为对照。90 d后取烟株根系调查病情指数，分级并记录结果，调查方法采用GB/T 23222—2008 《烟草病虫害分级及调查方法》。
1.2.3 功能微生物与完全腐熟的万寿菊秸秆有机肥复配 利用能够防治烟草青枯病的生防菌1号（Q1）、能够防治烟草黑胫病的生防菌2号（Q2）与上述试验中防效较好的菌株分别复配后添加到完全腐熟的万寿菊秸秆有机肥中，添加量为肥料总质量的1%，添加结束后按仓库正常堆贮条件堆放，定期检测各生防功能菌的有效活菌数，同时每天定时检测堆体上、中、下层的温度，连续检测10 d，并记录分析。
1.2.4 植烟地区田间效果验证 试验安排在曲靖市沾益区大坡乡，试验地块往年发病较为严重，试验前对土壤中线虫的虫口密度进行了统计，得出土壤中线虫的虫口密度为56头/100 g。
1.2.4.1 试验设计 试验采用随机区组设计，6个处理，3次重复，共18个小区。
处理1：空白对照，不施用任何有机肥料;处理2：施用万寿菊秸秆有机肥200 g/株;处理3：施用生防功能有机肥5号200 g/株;处理4：施用生防功能有机肥9号200 g/株;处理5：施用生防功能有机肥11号200 g/株;处理6：施用生防功能有机肥12号200 g/株。
每个小区植烟60株，株行距为120 cm×60 cm，植烟13 890株/hm2。每个处理施纯氮97.5 kg/hm2，氮、磷、钾质量比为1 ∶ 1.5 ∶ 3，各处理肥料具体用量详见表1。
施肥方法：烟草专用复合肥、普钙、硫酸钾、万寿菊秸秆有机肥和生防功能有机肥作基肥，其中万寿菊秸秆有机肥和生防功能有机肥在移栽前塘施，烟草专用复合肥、普钙和硫酸钾在移栽时中层环施;硝酸钾作追肥，在移栽后30 d左右兑水浇施。
植烟株数按13 890株/hm2计，单株肥料用量见表2。
1.2.4.2 土壤养分调查 在施肥前取一个基础土样，烤烟采烤后每个处理各取1个土样，合计7个土样（每个土样1 kg），对每个样品的土壤pH值、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾的含量进行检测分析。
1.2.4.3 生育期调查 分别观察记录每个处理50%烟株达到团棵、旺长、现蕾、封顶、采烤等生育期的时间。
1.2.4.4 农艺性状调查 在移栽后50 d和采烤前，每个小区试验选择5株有代表性的烟株测量其株高、茎围、叶片数、最大叶长和最大叶宽等农艺性状。
1.2.4.5 病害发生情况调查 在整个大田生育期对其他主要病害的发生情况以及采烤后取根系调查各处理根结线虫的发生情况及病情指数进行调查分级并记录结果，调查方法采用GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》。
1.2.4.6 产质量调查统计 每个处理单独挂牌烘烤，依据GB 2635—1992《烤烟》中42级国家烤煙分级标准分级，并统计产量和产值。各处理分别选取X2F、C3F、B2F（X2F表示下部叶橘黄色2级烟、C3F表示中部叶橘黄色3级烟、B2F表示上部叶橘黄色2级烟）各1 kg统一送检，进行烟叶内在化学成分分析。
2 结果与分析
2.1 具有拮抗烟草根结线虫的菌株筛选
2.1.1 具有灭杀根结线虫的功能生防菌筛选 由表3可知，利用试验前期筛选得到的对线虫具有灭杀活性的7株生防菌再次进行烟草根结线虫灭杀活性的筛选发现，各菌株发酵液均有灭杀活性，其中5、9、11、12号菌对线虫的校正致死率都在80%以上，分别达81.12%、84.28%、85.91%、82.36%，后续试验将选取以上4个菌株进一步开展。
2.1.2 不同稀释倍数发酵液对线虫活性的影响 由图1可知，不同稀释倍数发酵液对根结线虫的校正死亡率随着发酵倍数的增加而降低。稀释40倍后，各生防功能菌的抑杀活性大幅降低，稀释160倍后，生防菌的校正致死率均低于10%，稀释320倍后，各生防菌已基本丧失抑杀活性。
2.1.3 不同处理时间发酵液对线虫活性的影响 由图2可知，随着各菌株发酵液对线虫的处理时间增长，对线虫的抑杀活性越强，处理时间为2 h时，9号、11号菌株发酵液校正死亡率大幅高于5号、12号菌株发酵液，且较为相近，分别为81.69%和8159%;处理时间为3 h时，9号、11号菌株发酵液依然极为相近，且均高于其余2株菌株发酵液。整体而言，9号与11号菌株发酵液对线虫抑杀活性较高，且2 h后随着时间的延长抑杀活性增幅较小。
2.1.4 不同生防菌株对根结线虫温室烟草盆栽防效的测定 由表4的生防结果可知，4株生防功能能菌对烟草根结线虫均具有一定的防效，生防功能菌的病情指数均低于对照，生防效果依次为WSWFJ11