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[摘要] 目的 应用高效液相色谱法测定马尿酸乌洛托品片的有关物质。 方法 采用C18色谱柱（4.6mm×250mm，5?m），甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相，流速：0.9mL/min，检测波长：217nm。 结果 在选定的色谱条件下，马尿酸乌洛托品与有关物质分离完全.最低检测限为30ng，精密度良好（RSD=0.78%）。 结论 该方法简便、准确、专属性好、灵敏度高，可用于马尿酸乌洛托品片的有关物质测定。
[关键词] 马尿酸乌洛托品片；有关物质；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）18-118-03
马尿酸乌洛托品片主要成份为马尿酸乌洛托品，其化学名称为：1，3，5，7-四氮-三环[3，3，1，1]癸烷-单-N-苯甲酰甘氨酸盐。该片剂为下泌尿道感染的预防用药，适用于泌尿道术后及膀胱镜检查后留置导尿管者[1-2]。我们采用高效液相色谱法测定，优化了液相条件，建立了马尿酸乌洛托品片有关物质的测定方法，本法简便准确、专属性强，可用于马尿酸乌洛托品片的检测及质量控制。此法可靠、准确、方便、快速。
1 材料
日本岛津LC-10ATVP型高效液相色谱仪；SPD-1OAVP紫外可见检测器；ANASTAR色谱数据工作站；Mettler ToledoMx5型电子天平（瑞士梅特勒一托利多公司）；马尿酸乌洛托品对照品（批号为MKBC4167V）美国Sigma公司；马尿酸乌洛托品片（湖南明瑞制药有限公司，国药准字H10930055，批号：130219，130327，130411）；甲醇、乙腈（色谱纯，北京益利精细化学品有限公司）；磷酸（分析纯，广州化学试剂二厂）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性[3-11]
C18色谱柱（4.6mm×250mm，5?m）；甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相，流速：0.9mL/min，检测波长：217nm。理论塔板数按马尿酸乌洛托品峰计算应不低于
3000。马尿酸乌洛托品峰与其他相邻杂质峰之间的分离度应符合要求。
2.2 检测波长的选择
取马尿酸乌洛托品片适量，用流动相稀释后，用普析通用TU-1800SPC型紫外可见分光光度仪，按紫外分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA）[1]，在150～300nm波长范围内扫描，结果在217nm波长处有最大吸收，故确定检测波长定为217nm。
2.3 供试品溶液及预试溶液的制备
取马尿酸乌洛托品片适量，研细，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1毫升含马尿酸乌洛托品50μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释成每1毫升含马尿酸乌洛托品10μg的溶液，作为预试溶液。
2.4 辅料干扰试验
按马尿酸乌洛托品片处方制成缺马尿酸乌洛托品的空白辅料溶液，分别取适量空白辅料溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白辅料溶液在保留时间1.6min有吸收峰；而供试品溶液主峰保留时间为6.9min，其他杂质峰保留时间为4.2min，能与主峰有效分离，实验结果表明，辅料不干扰该品种有关物质的控制。见图1。
2.5 检测限考察
取空白基线一段，测量其噪音峰高，再将供试品溶液稀释成适当浓度，取10μL进行测定，使其主药峰高为噪音峰高的3倍，以其浓度计算最低检测量。结果表明：其检测限为30ng。
A.空白辅料溶液；B.供试品溶液；
1.辅料峰；2.主药杂质峰；3.主药主峰
图1 空白辅料溶液与供试品溶液HPLC图谱
2.6 方法专属性考察
为考察马尿酸乌洛托品片可能的降解产物及色谱条件的选择性，采用氧化、高温、光照、酸、碱对马尿酸乌洛托品片进行破坏性降解处理。
取马尿酸乌洛托品片适量，置研钵中研细，称取细粉适量（约相当于马尿酸乌洛托品10mg），置50mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀作为破坏实验贮液（A）。
精密量取破坏实验贮液，平行6份，分别经以下条件处理：（1）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为破坏对照溶液；（2）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加30%过氧化氢2mL，放置1h，加流动相至刻度；（3）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，置于100℃下加热破坏2h，放冷，加流动相至刻度；（4）取A适量，置于4000Lx的强光下照射2h，精密量取5mL，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度；（5）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加入2mol/mL的盐酸溶液2mL，放置2h，用氢氧化钠溶液中和后，加流动相稀释至刻度；（6）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加入0.1mol/mL的氢氧化钠溶液1mL，室温放置1h，用盐酸溶液中和后，加流动相稀释至刻度。
分别取上述破坏溶液溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰见图2，实验结果表明：马尿酸乌洛托品片对碱稳定，对氧化、对强光较稳定，对酸、高温不稳定。各降解产物在选定色谱条件下达到良好分离，说明该方法专属性良好。
a.破坏对照；b.氧化破坏；c.热破坏；d.强光破坏；
e.酸破坏；f.碱破坏；1.马尿酸乌洛托品
图2 破坏性试验HPLC色图谱
2.7 稳定性试验
取“2.3”项下制备的供试品溶液，分别于室温放置0，2，4，6，8，12h后，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，考察供试品溶液的稳定性，结果表明供试品溶液在测定期内是稳定的，RSD为0.56%。 2.8 精密度实验
取“2.3”项下制备的供试品溶液，连续进样6次，RSD为0.78%。
2.9 样品的测定
取“2.3”项下制备的预试溶液10μL调节检测灵敏度，使主成份色谱峰的峰高为满量程的50%～70%；再取“2.3”项下制备的供试品溶液10μL检测，记录色谱图至主成份色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液如显示杂质峰，扣除辅料峰，各杂质峰面积之和不得大于总峰面积的2.0%，单个杂质峰面积不得大于总峰面积的1.0%。经检测，3批马尿酸乌洛托品片的有关物质单个杂质峰占总峰面积分别是0.41%、0.45%、0.44%，各杂质峰的和占总峰面积分别是0.86%、0.79%、0.82%。
3 讨论
3.1 流动相的选择
分别以甲醇-水（50：50）、甲醇-0.1%磷酸溶液（65：35）和甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相，结果甲醇-水（50∶50）分离效果不佳；甲醇-0.1%磷酸溶液（65∶35）马尿酸乌洛托品与其它色谱峰均不能达到基线分离；甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）马尿酸乌洛托品与其它色谱峰均能达到基线分离.故选用甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相.
3.2 马尿酸乌洛托品片
原质量标准中仅采用滴定法进行了含量测定，未对其有关物质进行规定，本研究旨在制定该品种有关物质的控制方法，确保产品质量和人民用药安全。但对有关物质的结构分析还有待研究。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部）[S].2010：附录23.
[2] 国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准第63册[S].北京：人民卫生出版社，2006：99-102.
[3] 李莉，张钢平.高效液相色谱法测定乌洛托品片的含量[J].中国医院药学杂志，2009，29（4）：335-336.
[4] 辛志伟，臧志和，赵小玉，等.分光光度法测定乌洛托品的含量研究[J].数理医药学杂志，2001，14（6）：569.
[5] BB Lee，JM Simpson，JC Craig，et al.Methenamine hippurate for preventing urinary tract infections[J].Cochrane Database of Systematic Reviews （Online），2007，4：CD003265.
[6] L Wibell，A Scheynius，K Norrman.Methenamine-hippurate and bacteriuria in the geriatric patient with a catheter[J].Acta Medica Scandinavica，1980，207（6）：469-473.
[7] 刘加元，何胜利.HPLC测定长春西汀注射液的有关物质[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：137-139.
[8] 严小红，李春盈，陈安丽，等.氟康唑原料药有关物质的研究[J].中国药学杂志，2012，47（16）：1333-1336.
[9] 张晓艳，崔蕊，贾建静，等.HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊中的有关物质[J].华西药学杂志，2012，27（5）：585-587.
[10] 赵军军，李孝壁，马平平，等.HPLC法测定盐酸吉西他滨的有关物质[J].中国医药科学，2012，2（18）：106-108.
[11] 李群.HPLC法测定醋酸地塞米松片有关物质[J].中国医药科学，2012，2（5）：99-100.
（收稿日期：2013-07-05）
[关键词] 马尿酸乌洛托品片；有关物质；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）18-118-03
马尿酸乌洛托品片主要成份为马尿酸乌洛托品，其化学名称为：1，3，5，7-四氮-三环[3，3，1，1]癸烷-单-N-苯甲酰甘氨酸盐。该片剂为下泌尿道感染的预防用药，适用于泌尿道术后及膀胱镜检查后留置导尿管者[1-2]。我们采用高效液相色谱法测定，优化了液相条件，建立了马尿酸乌洛托品片有关物质的测定方法，本法简便准确、专属性强，可用于马尿酸乌洛托品片的检测及质量控制。此法可靠、准确、方便、快速。
1 材料
日本岛津LC-10ATVP型高效液相色谱仪；SPD-1OAVP紫外可见检测器；ANASTAR色谱数据工作站；Mettler ToledoMx5型电子天平（瑞士梅特勒一托利多公司）；马尿酸乌洛托品对照品（批号为MKBC4167V）美国Sigma公司；马尿酸乌洛托品片（湖南明瑞制药有限公司，国药准字H10930055，批号：130219，130327，130411）；甲醇、乙腈（色谱纯，北京益利精细化学品有限公司）；磷酸（分析纯，广州化学试剂二厂）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性[3-11]
C18色谱柱（4.6mm×250mm，5?m）；甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相，流速：0.9mL/min，检测波长：217nm。理论塔板数按马尿酸乌洛托品峰计算应不低于
3000。马尿酸乌洛托品峰与其他相邻杂质峰之间的分离度应符合要求。
2.2 检测波长的选择
取马尿酸乌洛托品片适量，用流动相稀释后，用普析通用TU-1800SPC型紫外可见分光光度仪，按紫外分光光度法（中国药典2010年版二部附录ⅣA）[1]，在150～300nm波长范围内扫描，结果在217nm波长处有最大吸收，故确定检测波长定为217nm。
2.3 供试品溶液及预试溶液的制备
取马尿酸乌洛托品片适量，研细，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1毫升含马尿酸乌洛托品50μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释成每1毫升含马尿酸乌洛托品10μg的溶液，作为预试溶液。
2.4 辅料干扰试验
按马尿酸乌洛托品片处方制成缺马尿酸乌洛托品的空白辅料溶液，分别取适量空白辅料溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白辅料溶液在保留时间1.6min有吸收峰；而供试品溶液主峰保留时间为6.9min，其他杂质峰保留时间为4.2min，能与主峰有效分离，实验结果表明，辅料不干扰该品种有关物质的控制。见图1。
2.5 检测限考察
取空白基线一段，测量其噪音峰高，再将供试品溶液稀释成适当浓度，取10μL进行测定，使其主药峰高为噪音峰高的3倍，以其浓度计算最低检测量。结果表明：其检测限为30ng。
A.空白辅料溶液；B.供试品溶液；
1.辅料峰；2.主药杂质峰；3.主药主峰
图1 空白辅料溶液与供试品溶液HPLC图谱
2.6 方法专属性考察
为考察马尿酸乌洛托品片可能的降解产物及色谱条件的选择性，采用氧化、高温、光照、酸、碱对马尿酸乌洛托品片进行破坏性降解处理。
取马尿酸乌洛托品片适量，置研钵中研细，称取细粉适量（约相当于马尿酸乌洛托品10mg），置50mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀作为破坏实验贮液（A）。
精密量取破坏实验贮液，平行6份，分别经以下条件处理：（1）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为破坏对照溶液；（2）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加30%过氧化氢2mL，放置1h，加流动相至刻度；（3）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，置于100℃下加热破坏2h，放冷，加流动相至刻度；（4）取A适量，置于4000Lx的强光下照射2h，精密量取5mL，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度；（5）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加入2mol/mL的盐酸溶液2mL，放置2h，用氢氧化钠溶液中和后，加流动相稀释至刻度；（6）精密量取A 5mL，置10mL容量瓶中，加入0.1mol/mL的氢氧化钠溶液1mL，室温放置1h，用盐酸溶液中和后，加流动相稀释至刻度。
分别取上述破坏溶液溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱峰见图2，实验结果表明：马尿酸乌洛托品片对碱稳定，对氧化、对强光较稳定，对酸、高温不稳定。各降解产物在选定色谱条件下达到良好分离，说明该方法专属性良好。
a.破坏对照；b.氧化破坏；c.热破坏；d.强光破坏；
e.酸破坏；f.碱破坏；1.马尿酸乌洛托品
图2 破坏性试验HPLC色图谱
2.7 稳定性试验
取“2.3”项下制备的供试品溶液，分别于室温放置0，2，4，6，8，12h后，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，考察供试品溶液的稳定性，结果表明供试品溶液在测定期内是稳定的，RSD为0.56%。 2.8 精密度实验
取“2.3”项下制备的供试品溶液，连续进样6次，RSD为0.78%。
2.9 样品的测定
取“2.3”项下制备的预试溶液10μL调节检测灵敏度，使主成份色谱峰的峰高为满量程的50%～70%；再取“2.3”项下制备的供试品溶液10μL检测，记录色谱图至主成份色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液如显示杂质峰，扣除辅料峰，各杂质峰面积之和不得大于总峰面积的2.0%，单个杂质峰面积不得大于总峰面积的1.0%。经检测，3批马尿酸乌洛托品片的有关物质单个杂质峰占总峰面积分别是0.41%、0.45%、0.44%，各杂质峰的和占总峰面积分别是0.86%、0.79%、0.82%。
3 讨论
3.1 流动相的选择
分别以甲醇-水（50：50）、甲醇-0.1%磷酸溶液（65：35）和甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相，结果甲醇-水（50∶50）分离效果不佳；甲醇-0.1%磷酸溶液（65∶35）马尿酸乌洛托品与其它色谱峰均不能达到基线分离；甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）马尿酸乌洛托品与其它色谱峰均能达到基线分离.故选用甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶25∶35）为流动相.
3.2 马尿酸乌洛托品片
原质量标准中仅采用滴定法进行了含量测定，未对其有关物质进行规定，本研究旨在制定该品种有关物质的控制方法，确保产品质量和人民用药安全。但对有关物质的结构分析还有待研究。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部）[S].2010：附录23.
[2] 国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准第63册[S].北京：人民卫生出版社，2006：99-102.
[3] 李莉，张钢平.高效液相色谱法测定乌洛托品片的含量[J].中国医院药学杂志，2009，29（4）：335-336.
[4] 辛志伟，臧志和，赵小玉，等.分光光度法测定乌洛托品的含量研究[J].数理医药学杂志，2001，14（6）：569.
[5] BB Lee，JM Simpson，JC Craig，et al.Methenamine hippurate for preventing urinary tract infections[J].Cochrane Database of Systematic Reviews （Online），2007，4：CD003265.
[6] L Wibell，A Scheynius，K Norrman.Methenamine-hippurate and bacteriuria in the geriatric patient with a catheter[J].Acta Medica Scandinavica，1980，207（6）：469-473.
[7] 刘加元，何胜利.HPLC测定长春西汀注射液的有关物质[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：137-139.
[8] 严小红，李春盈，陈安丽，等.氟康唑原料药有关物质的研究[J].中国药学杂志，2012，47（16）：1333-1336.
[9] 张晓艳，崔蕊，贾建静，等.HPLC测定牛磺熊去氧胆酸胶囊中的有关物质[J].华西药学杂志，2012，27（5）：585-587.
[10] 赵军军，李孝壁，马平平，等.HPLC法测定盐酸吉西他滨的有关物质[J].中国医药科学，2012，2（18）：106-108.
[11] 李群.HPLC法测定醋酸地塞米松片有关物质[J].中国医药科学，2012，2（5）：99-100.
（收稿日期：2013-07-05）