【摘 要】
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目的 建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型,对细胞内病毒蛋白和核酸的表达水平进行定量.方法 把neo抗性基因插入到Luc-JC1中,构建Luc-JC.将体外转录的Luc-JC RN
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目的 建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型,对细胞内病毒蛋白和核酸的表达水平进行定量.方法 把neo抗性基因插入到Luc-JC1中,构建Luc-JC.将体外转录的Luc-JC RNA转染Huh7细胞,经筛选后获得的G418抗性克隆,通过荧光素酶活性检测、Western blot和HCV NS3/4A对eYFP-MAVS的切割试验进行鉴定.用IFN-α处理筛选到的细胞,观察细胞中荧光素酶活性、HCV相关蛋白和RNA的变化,对复制细胞在抗病毒药物评价方面的应用进行初步验证.结果 G418加压筛选得到了多个含HCV全基因组的细胞克隆.在细胞克隆中,荧光素酶活性检测观察到萤火虫荧光素酶;Western blot检测到HCV NS3和NS5A蛋白的表达;由于NS3/4A的切割,eYFP-MAVS的定位由线粒体转移到细胞质.IFN-α处理阳性克隆细胞,荧光素酶活性、HCV蛋白表达和RNA水平明显降低.结论成功建立稳定的报告基因标记的HCV全基因组复制细胞模型,报告基因能用来指示细胞内HCV蛋白和RNA的表达水平,为进一步开展HCV致病机制研究和治疗药物筛选奠定了基础.
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