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摘要：为了解奶牛免疫A19疫苗和S2疫苗后的抗体消长规律，比较目前地市级实验室常用的3种血清学检测方法的效果，研究分别按厂家说明书对分别对60头试验奶牛进行免疫，使用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和竞争ELISA（cElisa）对免疫前1d至免疫后260d的血清样品进行检测。结果：2组奶牛血清样品经RBT、SAT、cELISA检测，抗体在28d达到峰值，且在21～56d保持较高水平，A19疫苗组260d仍未全部转阴，S2疫苗组在免疫后140d已全部转阴。A19疫苗的阳转率明显高于S2疫苗组并且抗体持续时间更长。
关键词：布鲁氏菌病;奶牛;A19和S2疫苗;血清学检测
中图分类号：S855.12
文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.12.001
0引言
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，病原是革兰氏阴性菌、兼性胞内寄生菌[1]。该病以公畜睾丸炎、母畜流产、产奶量下降等为主要症状[2]。布鲁氏菌进人机体被巨噬细胞吞噬，会有10%以上的细菌在巨噬细胞内定植。该菌根据形态差异分为粗糙型（rough，R）和光滑型（smooth，S）2种，光滑型具有完整的外膜结构，能刺激机体产生针对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的O-侧链的抗体，粗糙型布鲁氏菌没有O-侧链抗原[3]。常用的血清学检测方法中虎红平板凝集试验（RBT）是以布鲁氏菌细胞壁脂多糖上的O链抗原作为诊断位点，试管凝集试验（SAT）抗原检测光滑脂多糖抗体（S-LPS），ELISA方法主要以光滑型布鲁氏菌脂多糖抗原检测布鲁氏菌抗体[4-6]。
我国常用的布病疫苗包括牛种布鲁氏菌A19疫苗、猪种S2疫苗、羊种M5疫苗，均为光滑型[7]。现有的血清学检测方法无法区分野毒株和疫苗株。目前河南省用于奶牛布鲁氏菌防控的疫苗为A19株和S2株，这2种疫苗分别通过皮下注射和口服2种方式[8]。研究使用3种常用血清学检测方法对A19和S22种疫苗免疫后的抗体消长规律进行检测，结合本地实际探究合适的疫苗和检测方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1疫苗
布鲁氏菌病A19株活疫苗，金宇保灵生物药品有限公司，疫苗批号17942005;布鲁氏菌病S2株活疫苗，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，疫苗批号2017021。
1.1.2试剂
布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原及阴阳性血清，试管凝集抗原及阴阳性血清购自中国兽药监察所;cELISA试剂盒购自武汉科前公司。
1.1.3主要仪器
布病疫苗全封闭连续投药器（郑州灵格公司）;酶标仪（TECANSUNRISE），瑞士TECAN公司产品;洗板机（ELx50），美国Bio一Tek公司产品。
1.1.4试验动物
某养殖企业饲养，免疫前间隔2周连续采血3次，经虎红平板凝集试验、试管凝集试验和cELISA检测阴性且经流行病学调查无布鲁氏菌病感染史的66头0.5～2岁的奶牛。试验地点选在隔离圈进行，试验牛群与其他畜群无直接接触。1.2方法
（1）试验牛随机分组。见表1。
（2）免疫方法。将布病活疫苗A19株和S2株按照说明书所标注的含菌数量，用生理盐水稀释。皮下注射组奶牛（A19组）用连续注射器按1mL/头份注射布鲁氏菌A19疫苗，A19对照组皮下注射1mL/头生理盐水;口服组奶牛（S2组）用改装的连续注射器按2mL/头灌服布鲁氏菌S2疫苗，S2对照组灌服2mL/头生理盐水。
（3）安全性检测。A19和S2疫苗免疫后7d观察并记录奶牛发热、呼吸、食欲等状况。
（4）分别于免疫前1d和免疫后5、7、14、21、28、
56、84、112、140、168、196、224、260d采集试验组和对照组共924份血清，冷冻保存。
（5）虎红平板凝集试验、试管凝集试验按照GB/T18646-2018进行;cELISA按照试剂盒说明进行。
2结果
2.1疫苗安全性
疫苗免疫后，A19疫苗组30头奶牛中有5头出现发热、食欲减退，经1～3d均恢复正常，未见其他症状;S2疫苗组未见异常。
2.2转阳率检测情况
对采集的奶牛血清样品，采用RBT、SAT和cELISA檢测，对照组均为阴性。A19疫苗组与S2疫苗组在免疫21～56d抗体水平维持在较高水平，之后抗体水平随时间推移逐渐回落。3种血清学检测方法均显示，免疫奶牛后A19疫苗组抗体水平明显高于S2疫苗组，抗体产生速度更快，持续时间更长，见图1。
2.3A19免疫牛群3种血清学方法阳性率
A19疫苗免疫后，应用RBT、SAT和cELISA方法检测显示免疫后28d所有动物均为阳性，阳转率达到100%，说明此时奶牛机体内抗体水平达到最高水平。免疫84d后，抗体水平开始出现下降，cELISA较RBT和SAT检测抗体持续时间更长，表现出更好的灵敏性。见表2。
2.4S2免疫牛群3种血清学方法阳性率
S2疫苗免疫后，应用RBT、SAT和cELISA方法检测显示免疫后抗体转阳率始终低于30%，免疫后168d3种检测方法均未检测阳性血清。见表3。
3讨论
我国现有的A19疫苗是20世纪50年代从苏联引进的未缺失序列的S19株，毒力强于S2疫苗株，该毒株不适用于怀孕动物和公畜：免疫怀孕奶牛可引起1%～2.5%的流产和公畜持续睾丸炎[9]。S2疫苗是中国兽医药品监察所于1960年从猪胚筛选出的猪种布氏菌2号弱毒菌株，安全性较好，孕期家畜仍可使用[10]。目前认为清除胞内寄生菌主要依赖于细胞免疫，但是布鲁氏菌细胞免疫水平的检测尚不成熟，抗体水平通常与细胞免疫水平呈正比，可在很大程度上反映细胞免疫水平[11]。 结果表明，A19疫苗能刺激奶牛产生良好的免疫应答，阳转率和抗体持续时间明显优于S2疫苗，对奶牛免疫效果较好。在免疫方法上，口服法使用布病疫苗虽使用全封闭连续投药器，但对牛的保定和人员的操作水平有一定要求，实际免疫剂量和外泄数量较难控制。相比之下，皮内注射操作更为方便，免疫剂量更易控制。结合试验数据和2种疫苗的特点，建议本地区牛场有选择的使用2种疫苗：育成牛和产后母牛选择A19疫苗，孕牛选择S2疫苗。在免疫程序上可采取犊牛3～6月龄首免A19疫苗，6～8个月后加强免疫1次，此后及时监测抗体水平，根据需要每年加强1～2次;S2疫苗在使用时间隔3～4个月加强1次免疫。4结论
对比RBT、SAT.cELISA检测可知，RBT在2种疫苗免疫后5～28d敏感性高于另外2种检测方法。SAT在免疫后检测到抗体峰值水平的时间较两者晚且操作复杂、费时，判断时对操作人员的要求较高。cELISA表现出较SAT更好的敏感性，结果判定时人为误差较小，操作更为方便。根据试验结果并结合实际工作中的应用，建议在进行实验室检测中使用RBT方法进行初筛，用SAT或cELISA进行确诊。
参考文献
[1]ALEIXO MJ， FERRIRA M L， ANTUNES F. Brucellosis[J]. . Acta Med Port， 1999， 12 （ 12 ） ： 323-330.
[2]Gul S T， Khan A. Epidemiology and epizootology of brucellosis： review[J]. Pakistan Veterinary Journal， 2007， 27 （3 ） ： 145-151.
[3] Cloeckaert A， Grayon M， Verger JM， et al. Conservationof seven genes involved in the biosynthesi-s of the lipopolysaccharide O-side chain in Brucellaspp. [J]. ResMicrobiol， 2000， 151：209-216.
[4]Zhan Y， Yang J， Cheers c. Cytokine response of T-cell subsets from Brucella abortus-infected mice to soluble Brucella proteins[J]. Infect Immun， 1993， 61： 2 841-2 847.
[5]丁家波，冯忠武.动物布鲁氏菌疫苗应用现状及研究进展[J].生命科学，2013，25（1）;91-99.
[6]Skendros P， Pappas G， Boura P. Cell-mediated immunity in human brucellosis [J]. Microbes and Infection， 2011， 13 （2 ） ： 134-142.
[7]錢晶、犬布氏杆菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D].长春：吉林农业大学，2014.
[8]Beckett F W， MacDiarmid S C.The effect of reduced-dose Brucella abortus strain 19 vaccination in accredited dairy herds.Br VetJ， 1985， l41： 507-514.
[9]张海霞，孙晓梅，魏凯，等.布鲁氏菌病的研究进展[J].山东农业大学学报.2018，49（3）：402-407.
[10]李建玲，李爱巧，杨启元，等、乌鲁木齐牛羊布鲁氏菌疫.苗免疫效果对比试验[J].中国动物检疫，2013，2（4）：47-49.
[11]景志刚，严家瑞，范伟兴、布鲁氏菌病疫苗研究进展[J].中国人兽共患病学报，2016，32（2）：188-199.
关键词：布鲁氏菌病;奶牛;A19和S2疫苗;血清学检测
中图分类号：S855.12
文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.12.001
0引言
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，病原是革兰氏阴性菌、兼性胞内寄生菌[1]。该病以公畜睾丸炎、母畜流产、产奶量下降等为主要症状[2]。布鲁氏菌进人机体被巨噬细胞吞噬，会有10%以上的细菌在巨噬细胞内定植。该菌根据形态差异分为粗糙型（rough，R）和光滑型（smooth，S）2种，光滑型具有完整的外膜结构，能刺激机体产生针对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的O-侧链的抗体，粗糙型布鲁氏菌没有O-侧链抗原[3]。常用的血清学检测方法中虎红平板凝集试验（RBT）是以布鲁氏菌细胞壁脂多糖上的O链抗原作为诊断位点，试管凝集试验（SAT）抗原检测光滑脂多糖抗体（S-LPS），ELISA方法主要以光滑型布鲁氏菌脂多糖抗原检测布鲁氏菌抗体[4-6]。
我国常用的布病疫苗包括牛种布鲁氏菌A19疫苗、猪种S2疫苗、羊种M5疫苗，均为光滑型[7]。现有的血清学检测方法无法区分野毒株和疫苗株。目前河南省用于奶牛布鲁氏菌防控的疫苗为A19株和S2株，这2种疫苗分别通过皮下注射和口服2种方式[8]。研究使用3种常用血清学检测方法对A19和S22种疫苗免疫后的抗体消长规律进行检测，结合本地实际探究合适的疫苗和检测方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1疫苗
布鲁氏菌病A19株活疫苗，金宇保灵生物药品有限公司，疫苗批号17942005;布鲁氏菌病S2株活疫苗，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，疫苗批号2017021。
1.1.2试剂
布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原及阴阳性血清，试管凝集抗原及阴阳性血清购自中国兽药监察所;cELISA试剂盒购自武汉科前公司。
1.1.3主要仪器
布病疫苗全封闭连续投药器（郑州灵格公司）;酶标仪（TECANSUNRISE），瑞士TECAN公司产品;洗板机（ELx50），美国Bio一Tek公司产品。
1.1.4试验动物
某养殖企业饲养，免疫前间隔2周连续采血3次，经虎红平板凝集试验、试管凝集试验和cELISA检测阴性且经流行病学调查无布鲁氏菌病感染史的66头0.5～2岁的奶牛。试验地点选在隔离圈进行，试验牛群与其他畜群无直接接触。1.2方法
（1）试验牛随机分组。见表1。
（2）免疫方法。将布病活疫苗A19株和S2株按照说明书所标注的含菌数量，用生理盐水稀释。皮下注射组奶牛（A19组）用连续注射器按1mL/头份注射布鲁氏菌A19疫苗，A19对照组皮下注射1mL/头生理盐水;口服组奶牛（S2组）用改装的连续注射器按2mL/头灌服布鲁氏菌S2疫苗，S2对照组灌服2mL/头生理盐水。
（3）安全性检测。A19和S2疫苗免疫后7d观察并记录奶牛发热、呼吸、食欲等状况。
（4）分别于免疫前1d和免疫后5、7、14、21、28、
56、84、112、140、168、196、224、260d采集试验组和对照组共924份血清，冷冻保存。
（5）虎红平板凝集试验、试管凝集试验按照GB/T18646-2018进行;cELISA按照试剂盒说明进行。
2结果
2.1疫苗安全性
疫苗免疫后，A19疫苗组30头奶牛中有5头出现发热、食欲减退，经1～3d均恢复正常，未见其他症状;S2疫苗组未见异常。
2.2转阳率检测情况
对采集的奶牛血清样品，采用RBT、SAT和cELISA檢测，对照组均为阴性。A19疫苗组与S2疫苗组在免疫21～56d抗体水平维持在较高水平，之后抗体水平随时间推移逐渐回落。3种血清学检测方法均显示，免疫奶牛后A19疫苗组抗体水平明显高于S2疫苗组，抗体产生速度更快，持续时间更长，见图1。
2.3A19免疫牛群3种血清学方法阳性率
A19疫苗免疫后，应用RBT、SAT和cELISA方法检测显示免疫后28d所有动物均为阳性，阳转率达到100%，说明此时奶牛机体内抗体水平达到最高水平。免疫84d后，抗体水平开始出现下降，cELISA较RBT和SAT检测抗体持续时间更长，表现出更好的灵敏性。见表2。
2.4S2免疫牛群3种血清学方法阳性率
S2疫苗免疫后，应用RBT、SAT和cELISA方法检测显示免疫后抗体转阳率始终低于30%，免疫后168d3种检测方法均未检测阳性血清。见表3。
3讨论
我国现有的A19疫苗是20世纪50年代从苏联引进的未缺失序列的S19株，毒力强于S2疫苗株，该毒株不适用于怀孕动物和公畜：免疫怀孕奶牛可引起1%～2.5%的流产和公畜持续睾丸炎[9]。S2疫苗是中国兽医药品监察所于1960年从猪胚筛选出的猪种布氏菌2号弱毒菌株，安全性较好，孕期家畜仍可使用[10]。目前认为清除胞内寄生菌主要依赖于细胞免疫，但是布鲁氏菌细胞免疫水平的检测尚不成熟，抗体水平通常与细胞免疫水平呈正比，可在很大程度上反映细胞免疫水平[11]。 结果表明，A19疫苗能刺激奶牛产生良好的免疫应答，阳转率和抗体持续时间明显优于S2疫苗，对奶牛免疫效果较好。在免疫方法上，口服法使用布病疫苗虽使用全封闭连续投药器，但对牛的保定和人员的操作水平有一定要求，实际免疫剂量和外泄数量较难控制。相比之下，皮内注射操作更为方便，免疫剂量更易控制。结合试验数据和2种疫苗的特点，建议本地区牛场有选择的使用2种疫苗：育成牛和产后母牛选择A19疫苗，孕牛选择S2疫苗。在免疫程序上可采取犊牛3～6月龄首免A19疫苗，6～8个月后加强免疫1次，此后及时监测抗体水平，根据需要每年加强1～2次;S2疫苗在使用时间隔3～4个月加强1次免疫。4结论
对比RBT、SAT.cELISA检测可知，RBT在2种疫苗免疫后5～28d敏感性高于另外2种检测方法。SAT在免疫后检测到抗体峰值水平的时间较两者晚且操作复杂、费时，判断时对操作人员的要求较高。cELISA表现出较SAT更好的敏感性，结果判定时人为误差较小，操作更为方便。根据试验结果并结合实际工作中的应用，建议在进行实验室检测中使用RBT方法进行初筛，用SAT或cELISA进行确诊。
参考文献
[1]ALEIXO MJ， FERRIRA M L， ANTUNES F. Brucellosis[J]. . Acta Med Port， 1999， 12 （ 12 ） ： 323-330.
[2]Gul S T， Khan A. Epidemiology and epizootology of brucellosis： review[J]. Pakistan Veterinary Journal， 2007， 27 （3 ） ： 145-151.
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[6]Skendros P， Pappas G， Boura P. Cell-mediated immunity in human brucellosis [J]. Microbes and Infection， 2011， 13 （2 ） ： 134-142.
[7]錢晶、犬布氏杆菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究[D].长春：吉林农业大学，2014.
[8]Beckett F W， MacDiarmid S C.The effect of reduced-dose Brucella abortus strain 19 vaccination in accredited dairy herds.Br VetJ， 1985， l41： 507-514.
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[10]李建玲，李爱巧，杨启元，等、乌鲁木齐牛羊布鲁氏菌疫.苗免疫效果对比试验[J].中国动物检疫，2013，2（4）：47-49.
[11]景志刚，严家瑞，范伟兴、布鲁氏菌病疫苗研究进展[J].中国人兽共患病学报，2016，32（2）：188-199.