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摘 要 为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制，选择荔枝古树“宋荔”花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料，采用同源克隆和RACE方法，获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列，并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列，其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质，将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明：该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质，定位于微体（过氧化物酶体）和细胞质，具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp，含7个内含子，其中第4个内含子较长，达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因，该可变剪接基因提前终止，仅编码207个氨基酸的蛋白质，将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。
关键词 荔枝古树；胚性愈伤组织；Fe-SOD；克隆；可变剪接；生物信息学分析
中图分类号 S667.1 文献标识码 A
Cloning and Bioinformatics Analysis of Fe-SOD
Gene from Embryogenic Callus of
an Ancient Litchi Tree
LIAN Conglong， LAI Zhongxiong*， LU Bingguo， LIN Yuling， FENG Xin
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Two different mRNA transcripts and their genomic sequence of Fe-Superoxide dismutase gene were obtained with homologous and RACE from embryogenic callus of an ancient litchi tree‘Songli’， and the bioinformatics were analyzed to illustrate its role in the process of in vitro reservation. The full length of LcFe-SOD cDNA was about 1 285 bp，containing a 753-nucleotides-long open reading frame（ORF）which encoding a protein of 250 amino acid residues， named as LcFe-SOD7a. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by LcFe-SOD7a with transmembrane helices was hydrophilic， stable and acidic protein， mainly located in the microbody（peroxisome）and cytoplasm， and had a variety of phosphorylation sites. The genomic sequence of LcFe-SOD7a with a length of 2 284 bp was consisted of seven introns， with the fourth intron 920 bp， the longest. Meanwhile， an intron kept alternative splicing gene， named LcFe-SOD7b， which encoding a protein of 207 amino acid residues was obtained， which causing protein encoding terminated in advance.
Key words An ancient litchi tree； Embryogenic callus； Fe-SOD； Cloning； Alternative splicing； Bioinformatics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.013
超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生物体中的金属酶，具有防御氧毒性、清除体内氧自由基等作用，在植物抗氧化、抗逆等方面起着关键的作用[1]。该酶分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD三种类型。各类型在生物体中都发挥着重要的作用，相互协调又各有分工。对SOD的转基因烟草[2]、拟南芥[3]、苜蓿[4]、土豆[5]、水稻[6]等研究结果表明：叶绿体SOD的过量表达，提高了它们抗氧化胁迫的能力。以往的研究结果表明，在转SOD基因植株中的SOD过量表达能不同程度的提高植物抗氧化胁迫能力。其中，Fe-SOD的研究相对较少，McKersie曾报道在紫花苜蓿中过量表达Fe-SOD可以增强其对严寒冬季的耐受力[7]；郁万文等[8]研究发现梯度低温处理能够诱导银杏总的SOD活性升高，而在4 ℃低温处理中，银杏Mn-SOD和Fe-SOD表达量都有大幅度提高，说明银杏中Mn-SOD和Fe-SOD参与了银杏对低温胁迫的适应；Fe-SOD在烟草和玉米叶绿体中的过量表达增强了转基因烟草和玉米对质膜的光系统II的保护作用和对除草剂引起的氧化胁迫的耐受性，但它们对冷害和盐胁迫的耐受性并没有提高[9-10]。 荔枝（Litchi chinesis Sonn.）原产我国，属于无患子科（Sapindaceae）荔枝属（Litchi），是亚热带常绿乔木果树，为岭南四大佳果之一，具有很高的经济价值。古树的价值重大，包括文化、经济和科学研究等，被誉为“活化石”，是极其宝贵的植物种质资源[11]。“宋荔”作为千年的荔枝古树，是一道特异的自然、园林和人文景观，具有较高的研究意义。其历经千百年的历史沧桑，长时间复杂的气候考验，不仅表现了强大的生存适应能力，代表着荔枝的长期演化过程，拥有其长久的生存机制。SOD基因家族在植物的整个生命历程中作为抗氧化系统的第一道防线，是维持植物生长过程中活性氧的代谢平衡的基础，防止其衰老而历经千年，在荔枝古树的生长过程中是否拥有其自身独特的作用机理有待研究，许珊珊[12]对本品种进行了SOD基因的克隆与表达研究，获得SOD家族的12个mRNA转录本，其中9个Fe-SOD，1个Mn-SOD和2个Cu/Zn-SOD。本研究在前期工作基础上，选择荔枝古树“宋荔”花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料，采用同源克隆和RACE方法，对荔枝古树SOD基因家族中剩余的Fe-SOD成员进行了克隆和生物信息学分析，这为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制，以及进一步完善、全面研究Fe-SOD基因在荔枝古树中的时空表达特性、探索其调控途径、作用的分子机理和转基因的抗逆性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采自福州西禅寺的“宋荔”花药诱导而来并每隔20 d继代培养的胚性愈伤组织，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所保存。
1.2 方法
1.2.1 总RNA和DNA的提取及模板的合成 采用Tripure Isolation Reagent（Roche）和改良CTAB法[13]分别提取总RNA和DNA，并分别经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和纯度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒及AP作为接头引物逆转录合成cDNA第一链用于保守区及3′ RACE扩增。而Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成5′ RACE的模板。
1.2.2 引物的设计合成 检索GenBank上登录的与荔枝亲缘关系较近物种的Fe-SOD的同源序列，设计简并引物扩增保守区。根据保守区的测序结果设计3′ RACE和5′ RACE的两条正向和两条反向基因特异引物分别与3′端的通用引物AUAP和5′端的通用引物UPM扩增其3′端和5′端。将所获得的序列片段进行拼接，并根据相近物种的Fe-SOD基因组序列设计ORF框验证及该基因的基因组序列引物。本研究所用引物设计及序列分析都采用DNAMAN6.0软件完成，设计好的引物均委托华大基因公司合成。本研究中使用的引物见表1。
1.2.3 目的片段扩增 基因及基因组序列扩增PCR反应体系为：模板1 μL（5 ng/μL）；上、下游引物各1 μL（10 μmol/L）；DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）12.5 μL；加ddH2O至总体积25 μL。
PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，退火30 s（各退火温度见表1），72 ℃延伸按1 min/kb计算，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。
1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序 通过琼脂糖（1%）电泳检测基因PCR扩增产物，割胶回收目的片段。连接pMD18-T，并转化DH5a，挑取阳性克隆子菌液检测合格后送华大基因公司测序。
1.2.5 LcFe-SOD的生物信息学分析 首先使用GSDS软件及DNAMAN6.0软件对基因组序列进行内含子及可变剪接分析。其次，利用ExPASy Protparam预测其基本理化性质；SignalP 4.1 Server和PSORT预测蛋白质信号肽与亚细胞定位情况；蛋白质跨膜区段的预测使用EMBnet TMpred程序；以NCBI-CDS预测分析保守结构域；EMBnet COILS用来预测蛋白卷曲螺旋结构；蛋白质二级及三级结构的预测使用PredictProtein、PSIPRED和SWISS-MODEL在线软件；NetPhos 2.0对蛋白磷酸化位点及分布进行预测；PredictProtein预测蛋白质具体的功能位点；分子系统进化树的构建使用MEGA5.02软件（Neighbor-Joining，邻位相连法，NJ）。
2 结果与分析
2.1 荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD cDNA全长的扩增及测序
LcFe-SOD基因保守区扩增电泳检测结果得到约600 bp的特异性条带（图1-A-1），与预期目的条带大小相符，测序为615 bp。并将测序得到的序列在NCBI的GenBank数据库中在线进行Blast，显示与其它物种的Fe-SOD基因有高度的同源性，其中同龙眼中的DlFSD1b基因仅个别碱基差别。初步推断它们是荔枝LcFe-SOD基因的保守序列。
LcFe-SOD的3′端扩增产物电泳检测结果得到约500 bp的特异性条带（图1-B-3），与预期目的条带大小相符，测序为490 bp。测序结果和软件分析结果表明：所得3′ RACE序列与保守区序列有90 bp的重复片段，并经NCBI上Blast表明，所得序列为荔枝LcFe-SOD基因的3′端序列。
LcFe-SOD的5' RACE的扩增产物为约400 bp的条带（图1-B-5），与预期目的条带大小相符，测序为401 bp。测序和软件分析结果表明：所得序列与保守区序列有120 bp的重复片段。并经NCBI上Blast表明，所得序列为荔枝LcFe-SOD基因的5′端序列。 将实验获得LcFe-SOD基因的5′ RACE序列、保守区序列和3′ RACE序列进行拼接。设计相应ORF验证引物，扩增所得电泳条带如图1-C-6，测序得到长达857 bp，与拼接所得序列一致。因此，获得该基因全长1 285 bp，包含146 bp的5′ UTR，753 bp的ORF及386 bp的3′ UTR（含poly A），将所得序列全长翻译得该序列由250个氨基酸组成。在线进行Blast分析表明所得片段为荔枝LcFe-SOD的基因序列，命名为LcFe-SOD7a（GenBank登入号：KC492109）。
2.2 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因组序列扩增及内含子分析
荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因组序列的PCR扩增图像显示约2 200 bp处得1特异性条带（图1-D-8）。测序得LcFe-SOD7a基因组全长2 284 bp，将该扩增序列与ORF的cDNA序列进行比对，结果显示除了内含子序列外，其它序列完全一致。DNAMEN比对和GSDS软件分析表明，发现该基因由7个内含子和8个外显子组成，其内含子剪接位点符合真核生物GT-AG规则，所得序列结构如图2。外显子的长度依次为72、66、192、172、74、27、24、126 bp，平均长度为94 bp；内含子的长度个别波动相对较大，分别为80、83、91、920、71、101、81 bp，平均长度为204 bp，其最长达920 bp，占该基因组长度的40.28%。将荔枝LcFe-SOD7a的基因组与相应的龙眼基因组比较发现，其同源性高达88.00%。
2.3 荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因可变剪接获得与分析
在对LcFe-SOD7a基因ORF验证的过程中，挑取单克隆子进行菌液PCR鉴定，发现其中1个单克隆子条带上存在差异（图1-C-6），将两管菌液分别测序。测序得1条长857 bp的序列，其序列与拼接的序列完全符合，而另一条长928 bp的序列。将两条基因比对，发现后者仅在中间多出71 bp，其它碱基序列完全相同。将两者和基因组序列比对，所得的928 bp序列插入了完整的第5个内含子，从而多出71 bp，为LcFe-SOD7a基因的1条可变剪接基因，属内含子驻留型[14-15]。将该可变剪接序列进行翻译，其序列有完整的编码框，相对于LcFe-SOD7a的编码序列，其终止密码子提早出现，产生了一个与原蛋白质有很大部分重叠的新的蛋白质。将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b（GenBank登入号：KC492110）。这和龙眼的DlFSD1b基因[15]类似。
2.4 荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因的生物信息学分析
2.4.1 蛋白质的理化性质分析 对荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因编码蛋白质的理化性质进行分析，初步了解该蛋白的生理生化特性，为探讨其功能和作用的分子机理奠定基础。首先，利用ExPASy ProtParam工具预测结果表明，LcFe-SOD7a蛋白相对分子质量为28 967.1，总原子数为4 053，分子式为C1 331H2 002N344O368S8；该蛋白由19种氨基酸组成，其中以亮氨酸（Leu）含量最丰富，比例达到11.6%，其次是赖氨酸（Lys）占7.2%；该蛋白不稳定系数为33.88；总平均疏水性为-0.435；所带负电的氨基酸（Asp+Glu）和正电的氨基酸（Arg+Lys）数分别为31和28个，理论等电点为6.25；说明该蛋白是稳定的、亲水的偏酸性蛋白质。
进一步使用在线SignalP 4.1软件和亚细胞定位分析表明，LcFe-SOD7a基因编码的蛋白质不属于分泌蛋白，没有典型的信导肽，定位于微体（过氧化物酶体）的可能性是0.640、细胞质的可能性是0.450，这和同源物种龙眼的结论[15]完全一致。最后，对 LcFe-SOD7a蛋白的跨膜区进行的预测结果显示该蛋白含3个跨膜螺旋，由外到内的跨膜结构只有1个，长达18个氨基酸，位于第151～168个残基之间，分值为931；而另两个是由内到外的跨膜结构，分别位于第151～169和215～231个残基之间，第1个分值为660，其中第2个跨膜结构不显著，分值仅34；分值比较分析，推测荔枝LcFe-SOD7a蛋白属跨膜蛋白，其跨膜模型属于N 末端朝外的由外到内进行跨膜的可能性很大。综合上述分析，推测荔枝Lc-SOD7a蛋白主要存在于微体（过氧化物酶体）和细胞质上，通过由外到内的跨膜运动，在荔枝古树的胚性愈伤组织离体保存中发挥着生物学功能。
LcFe-SOD7b蛋白理化性质预测表明：该蛋白不稳定系数为39.40，总平均疏水性为-0.440，带正、负电的氨基酸数分别为22和26个，理论等电点为5.97，说明该蛋白也是稳定的、亲水的酸性蛋白质。定位于微体（过氧化物酶体）和细胞质的可能性分别为0.640和0.450，与LcFe-SOD7a一致，说明该基因的定位信号位点位于该基因的前半部。跨膜分析表明，存在2个跨膜螺旋，跨膜模型也是倾向于N 末端朝外的由外到内进行跨膜。综上分析，两蛋白的理化性质相近，推测两者行使相同的生理生化作用，相辅相成，共同调控着荔枝古树胚性愈伤组织的离体保存。
2.4.2 蛋白质结构特征分析 蛋白结构与其发挥的功能密切相关。首先，通过NCBI-CDS在线分析LcFe-SOD7a保守结构域，该蛋白含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N两个保守结构域，以上两结构域同属PLN02622多结构域（图3）。EMBnet COILS显示，仅在参数window=14的情况下，LcFe-SOD蛋白在氨基酸序列约165～185之间有形成卷曲螺旋结构的可能性。通过PredictProtein在线软件分析其蛋白二级结构，结果表明该蛋白不含普通的二级结构，无NORS区域，主要由51.2%的螺旋（Helix），6.8%的Strand，42%的环（Loop）构成。PSIPRED也表明LcFe-SOD7a蛋白的结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成，其中β折叠和无规则卷曲分布在整个氨基酸序列中。同时利用软件SWISS-MODEL对荔枝LcFe-SOD7a进行三维结构的预测，结果如图4-A。 LcFe-SOD7b的蛋白质结构分析表明：也含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N两个保守结构域，无NORS区域，主要由45.4%的螺旋（Helix），10.6%的Strand，44%的环（Loop）构成，三维结构预测结果如图4-B。从图中也可以看出LcFe-SOD7a结构与LcFe-SOD7b无明显差异，LcFe-SOD7a仅比LcFe-SOD7b多出部分结构。因此推测该可变剪接基因与原基因有着相同的功能，共同调控，协调发挥该基因的应有功能。
2.4.3 氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测 蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后最常见和最重要的一种修饰方式，生物体内的许多生命活动都有参与和调控。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程[16]。采用在线软件NetPhoS 2.0和PredictProtein分析LcFe-SOD7a蛋白潜在的磷酸化位点，有助于了解荔枝LcFe-SOD7a蛋白在翻译后水平上调控方式。 对荔枝LcFe-SOD7a基因编码蛋白通过NetPhoS 2.0预测显示其存在12个潜在的磷酸化位点，如图5所示，分布于整条多肽链中。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点数分别是3、2和7。上述结果表明，LcFe-SOD7a蛋白中磷酸化位点的存在对LcFe-SOD7a蛋白所发挥的功能可能是必须的，调控着荔枝古树胚性愈伤组织的保存。
进一步通过PredictProtein对LcFe-SOD7a蛋白具体所含的磷酸化位点预测结果表明，该蛋白含2个cAMP-和cGMP-dependent蛋白激酶磷酸化位点（CAMP_PHOSPHO_SITE）、2个蛋白激酶C磷酸化位点（PKC_Phospho_site）、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点（CK2_ Phospho_site）、2 个N-酰基化位点（Myristyl）和两个锰铁超氧化物酶信号位点（SOD_MN）（图3）。这些不同的位点可能赋予有不同的酶活性及蛋白结构，而荔枝LcFe-SOD7a蛋白的这些位点组合，从而协同作用产生不同的生物学功能，共同调控荔枝古树胚性愈伤组织的生长保存。
LcFe-SOD7b基因编码蛋白比较分析，NetPhoS 2.0预测显示荔枝存在9个潜在的磷酸化位点，少了3个酪氨酸；PredictProtein显示少了两个锰铁超氧化物酶信号位点（SOD_MN）。
2.5 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因编码的蛋白质同源性和进化分析
同源序列比对结果显示，LcFe-SOD7a翻译的氨基酸序列与同源物种龙眼（Dimocarpus longan ADK70232）的同源性最高达96.4%；与模式植物拟南芥的相似性为71.86%；与藻类植物的莱茵衣藻、苔藓类植物地钱、裸子植物银杏及单子叶植物玉米相似性分别为43.6%、47.47%、48.63%、63.32%，从数据中也体现该基因的进化符合经典的植物进化过程。
对来自14条不同物种的Fe-SOD氨基酸序列采用Mega5.02近邻相接法（Neighbor-Joming，NJ）做进化树分析，进化树中bootstrap值为数字代表，重复检测1 000次。进化树如图6所示，该14条序列分成两个大分支。其中藻类、苔藓类、蕨类和裸子植物为一大分支；被子植物为另一大分支。在被子植物中，单子叶植物和双子叶植物各位一支。从该进化树上可以看出，该基因的进化符合经典的物种进化过程。
3 讨论与结论
3.1 生物信息学初步推测荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因的潜在功能分析
荔枝古树在整个生长发育过程中历经千年必然受到各种逆境的影响，如台风、亚热带的异常高温、辐射、盐碱、病原菌侵染和人为破坏等，这些逆境因素均能导致细胞产生大量的超氧化物阴离子自由基，而大量自由基的积累容易导致植物的早衰。但荔枝古树却历经千年而不衰，其内部活性氧的生成和清除能够千年地维持在动态平衡之中，是值得研究的关键。这种动态平衡的维持主要是通过超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶或非酶类的胡萝卜素（CAR）、抗坏血酸（ASA）和还原性谷胱甘肽（GSH）反应进行系统调节的[17]。其中SOD作为抗氧化系统的第一道防线，必然起着不可替代的作用。对LcFe-SOD7a基因的生物信息学分析表明该基因编码的蛋白是亲水的、稳定的、具有跨膜结构域的偏酸性蛋白质。跨膜蛋白是介导细胞与外界之间的信号传导，处于细胞与外界的交界部位，并执行很多重要的细胞生物学功能，例如，参与细胞膜内外物质交换、能量和信号的传递；构成各种信号分子、激素和其他底物的受体；构成各种离子跨膜的通道，把营养物质和一些无机电解质输入细胞，而将有毒的或无用的代谢产物排出细胞等作用[18-19]。因此，跨膜结构域的存在也为该蛋白行使以上功能提供可能。同时磷酸化位点分析表明，该蛋白存在一些蛋白激酶的磷酸化位点，而大量的研究表明，蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程普遍存在于生物体内，涉及到光合作用、糖代谢、生长发育、基因表达等多种生理过程[20-22]，表明该蛋白可能在上述生理过程中发挥某种作用。因此，若要研究该基因的作用机理，还有待进一步研究SOD酶活性变化、定量表达及功能验证等。
3.2 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因的可变剪接现象及作用分析
可变剪接被认为是导致蛋白功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物[23]。同时，也是产生基因组规模与生物复杂性之间的矛盾的根源之一[24]。已有实验研究表明，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用。在植物界的研究中普遍存在可变剪接现象，龙眼[15]、茄子[25]、番茄[26]、玉米[27]、拟南芥[28]和水稻[29]等都有报道。其中，在SOD基因家族中，可变剪接现象也普遍存在，林玉玲[15]首次对木本植物的SOD进行了较完整的克隆研究，并对其可变剪接进行了分析。本实验室汤燕姗[30]、朱伟玲[31]分别对桃和油柿的SOD研究中，发现Fe-SOD也都存在可变剪接。利用Z.mays EST数据库分析显示FSD和CSD基因存在大量变体序列，而这很可能是由于可变剪接或内含子不同剪接效率造成的[32]。在杨树中hipI-SODC1b基因和hipI-SODC1s基因是hipI-SODC1的2个变体，其中hipI-SODC1b比hipI-SODC1s多出的69 bp正是来自于hipI-SODC的第6个内含子[33]。本实验对该基因研究中所得的一条可变剪接，插入了一个完整的内含子，并使序列提前终止，可以翻译完整的蛋白质，表现了该基因表达多样的蛋白。对该可变剪切基因的理化性质及结构分析表明，两蛋白之间并未存在显著差异，可以推测该可变剪接基因在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中与原基因相互协调，有着相似的作用机理。而许珊珊[12]对荔枝的Fe-SOD其它成员的可变剪接分析表明其可变剪接参与细胞活性氧的清除是通过影响信号传递和亚细胞定位来进行的，进而调控其保存中的生长发育。但本实验对该可变剪接蛋白质是否发挥了其它的功能作用，以及其表达量等有待于进一步研究。参考龙眼[15]中该成员基因的研究，共得到该基因的4条可变剪接基因，因此，在荔枝中该基因可能还存在其它的可变剪接现象，又或许正是这种可变剪接的差异对荔枝和龙眼的不同起着一定的影响。 参考文献
[1] Bubliy O， Loeschcke V. Correlated responses to selection for stress resistance and longevity in a laboratory population of Drosophila melanogaster[J]. Journal of Evolutionary Biology， 2005， 18（4）： 789-803.
[2] Van Camp W， Capiau K， Van Montagu M， et al. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts[J]. Plant physiology， 1996， 112（4）： 1 703-1 714.
[3] Tsugane K， Kobayashi K， Niwa Y， et al. A recessive Arabidopsis mutant that grows photoautotrophically under salt stress shows enhanced active oxygen detoxification[J]. The Plant Cell Online， 1999， 11（7）： 1 195-1 206.
[4] McKersie B D， Chen Y， de Beus M， et al. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa（Medicago sativa L.）[J]. Plant physiology， 1993， 103（4）： 1 155-1 163.
[5] Perl A， Perl-Treves R， Galili S， et al. Enhanced oxidative-stress defense in transgenic potato expressing tomato Cu， Zn superoxide dismutases[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics， 1993， 85（5）： 568-576.
[6] Tanaka Y， Hibino T， Hayashi Y， et al. Salt tolerance of transgenic rice overexpressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts[J]. Plant Science， 1999， 148（2）： 131-138.
[7] McKersie B D， Murnaghan J， Jones K S， et al. Iron-superoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance[J]. Plant physiology， 2000， 122（4）： 1 427-1 438.
[8] 郁万文， 曹福亮， 汪贵斌，等. 银杏抗氧化酶系统对短期梯度变温的响应[J]. 江西农业大学学报， 2008， 30（2）： 252-255.
[9] Van Breusegem F， Slooten L， Stassart J M， et al. Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize[J]. Plant and cell physiology， 1999， 40（5）： 515-523.
[10] Van Camp W， Bowler C， Villarroel R， et al. Characterization of iron superoxide dismutase cDNAs from plants obtained by genetic complementation in Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1990， 87（24）： 9 903-9 907.
[11] 赖钟雄， 李焕苓. 古树名木基因资源的挖掘与利用[J]. 国土绿化， 2007（5）： 6-7.
[12] 许珊珊. 福州荔枝古树离体种质保存及抗性基因SOD的克隆与表达[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[13] 丁晓东， 吕柳新. 从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究[J]. 应用与环境生物学报， 2000， 6（2）： 142-145.
[14] Werneke J M， Chatfield J M， Ogren W L. Alternative mRNA splicing generates the two ribulosebisphosphate carboxylase/ oxygenase activase polypeptides in spinach and Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online， 1989， 1（8）： 815-825. [15] 林玉玲. 龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2011.
[16] 姜 铮， 王 芳， 何 湘， 等. 蛋白质磷酸化修饰的研究进展[J]. 生物技术通讯， 2009（2）： 233-237.
[17] Gupta S D， Datta S. Antioxidant enzyme activities during in vitro morphogenesis of gladiolus and the effect of application of antioxidants on plant regeneration[J]. Biologia Plantarum， 2003， 47（2）： 179-183.
[18] Rinalducci S， Zolia L， Timperio A M. Photosynthetic membrane proteomics[J]. Plant molecules： basic and applied research， 2006， 5： 99.
[19] Aldape M J， Elmer A M， Chao W S， et al. Identification and characterization of a sucrose transporter isolated from the developing cotyledons of soybean[J]. Archives of biochemistry and biophysics， 2003， 409（2）： 243-250.
[20] Gilbert C， Gaudry M， Naccache P H. Rapid priming of calcium mobilization and superoxide anion production in human neutrophils by substimulatory concentrations of phorbol esters： a novel role for protein kinase C and tyrosine phosphorylation in the up-modulation of signal transduction[J]. Cellular signalling， 1992， 4（5）： 511-523.
[21] Ahmed K， Davis A T， Wang H， et al. Significance of protein kinase CK2 nuclear signaling in neoplasia[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2000， 79（S35）： 130-135.
[22] Lin R， Hiscott J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity[J]. Molecular and cellular biochemistry， 1999， 191（1-2）： 169-180.
[23] Roberts G C， Smith C W. Alternative splicing： combinatorial output from the genome[J]. Current opinion in chemical biology， 2002， 6（3）： 375-383.
[24] Harrison P M， Kumar A， Lang N， et al. A question of size： the eukaryotic proteome and the problems in defining it[J]. Nucleic acids research， 2002， 30（5）： 1 083-1 090.
[25] 罗 艳， 王 瑛. 茄子SmU2AF 65基因的可变剪接[J]. 遗传， 2008， 30（11）： 1 499-1 505.
[26] 宋晓毅， 徐幼平， 张志新， 等. 8个番茄ACE全长cDNA序列的克隆和分析[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2009， 35（3）： 249-254.
[27] 王存芳， 李记园， 王茅雁. 玉米ZmCBL5-2基因的克隆及其转化拟南芥[J]. 内蒙古农业大学学报： 自然科学版， 2011， 32（1）： 162-166.
[28] Iida K， Seki M， Sakurai T， et al. Genome-wide analysis of alternative pre-mRNA splicing in Arabidopsis thaliana based on full-length cDNA sequences[J]. Nucleic acids research， 2004， 32（17）： 5 096-5 103.
[29] 康海岐， 申国安， 程在全， 等. 水稻ⅡB型拓扑异构酶OsSpo11基因的cDNA克隆， 表达谱分析及其可变剪接的检测[J]. 中山大学学报： 自然科学版， 2008， 47（1）： 88-92.
[30] 汤燕姗. 桃梨离体保存及桃SOD基因的克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[31] 朱伟玲. 福建柿子种质资源离体保存及其试管苗叶片SOD基因克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[32] Katyshev A， Rogozin I， Konstantinov Yu M. identification of new superoxide dismutase transcripts in plants by est analysis： alternative polyadenylation and splicing events[J]. Computational structural and functional genomics and transcriptomics， 2006.
[33] Srivastava V， Srivastava M K， Chibani K， et al. Alternative splicing studies of the reactive oxygen species gene network in Populus reveal two isoforms of high-isoelectric-point superoxide dismutase[J]. Plant physiology， 2009， 149（4）： 1 848-1 859.
责任编辑：沈德发
关键词 荔枝古树；胚性愈伤组织；Fe-SOD；克隆；可变剪接；生物信息学分析
中图分类号 S667.1 文献标识码 A
Cloning and Bioinformatics Analysis of Fe-SOD
Gene from Embryogenic Callus of
an Ancient Litchi Tree
LIAN Conglong， LAI Zhongxiong*， LU Bingguo， LIN Yuling， FENG Xin
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Two different mRNA transcripts and their genomic sequence of Fe-Superoxide dismutase gene were obtained with homologous and RACE from embryogenic callus of an ancient litchi tree‘Songli’， and the bioinformatics were analyzed to illustrate its role in the process of in vitro reservation. The full length of LcFe-SOD cDNA was about 1 285 bp，containing a 753-nucleotides-long open reading frame（ORF）which encoding a protein of 250 amino acid residues， named as LcFe-SOD7a. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by LcFe-SOD7a with transmembrane helices was hydrophilic， stable and acidic protein， mainly located in the microbody（peroxisome）and cytoplasm， and had a variety of phosphorylation sites. The genomic sequence of LcFe-SOD7a with a length of 2 284 bp was consisted of seven introns， with the fourth intron 920 bp， the longest. Meanwhile， an intron kept alternative splicing gene， named LcFe-SOD7b， which encoding a protein of 207 amino acid residues was obtained， which causing protein encoding terminated in advance.
Key words An ancient litchi tree； Embryogenic callus； Fe-SOD； Cloning； Alternative splicing； Bioinformatics
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.013
超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生物体中的金属酶，具有防御氧毒性、清除体内氧自由基等作用，在植物抗氧化、抗逆等方面起着关键的作用[1]。该酶分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD三种类型。各类型在生物体中都发挥着重要的作用，相互协调又各有分工。对SOD的转基因烟草[2]、拟南芥[3]、苜蓿[4]、土豆[5]、水稻[6]等研究结果表明：叶绿体SOD的过量表达，提高了它们抗氧化胁迫的能力。以往的研究结果表明，在转SOD基因植株中的SOD过量表达能不同程度的提高植物抗氧化胁迫能力。其中，Fe-SOD的研究相对较少，McKersie曾报道在紫花苜蓿中过量表达Fe-SOD可以增强其对严寒冬季的耐受力[7]；郁万文等[8]研究发现梯度低温处理能够诱导银杏总的SOD活性升高，而在4 ℃低温处理中，银杏Mn-SOD和Fe-SOD表达量都有大幅度提高，说明银杏中Mn-SOD和Fe-SOD参与了银杏对低温胁迫的适应；Fe-SOD在烟草和玉米叶绿体中的过量表达增强了转基因烟草和玉米对质膜的光系统II的保护作用和对除草剂引起的氧化胁迫的耐受性，但它们对冷害和盐胁迫的耐受性并没有提高[9-10]。 荔枝（Litchi chinesis Sonn.）原产我国，属于无患子科（Sapindaceae）荔枝属（Litchi），是亚热带常绿乔木果树，为岭南四大佳果之一，具有很高的经济价值。古树的价值重大，包括文化、经济和科学研究等，被誉为“活化石”，是极其宝贵的植物种质资源[11]。“宋荔”作为千年的荔枝古树，是一道特异的自然、园林和人文景观，具有较高的研究意义。其历经千百年的历史沧桑，长时间复杂的气候考验，不仅表现了强大的生存适应能力，代表着荔枝的长期演化过程，拥有其长久的生存机制。SOD基因家族在植物的整个生命历程中作为抗氧化系统的第一道防线，是维持植物生长过程中活性氧的代谢平衡的基础，防止其衰老而历经千年，在荔枝古树的生长过程中是否拥有其自身独特的作用机理有待研究，许珊珊[12]对本品种进行了SOD基因的克隆与表达研究，获得SOD家族的12个mRNA转录本，其中9个Fe-SOD，1个Mn-SOD和2个Cu/Zn-SOD。本研究在前期工作基础上，选择荔枝古树“宋荔”花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料，采用同源克隆和RACE方法，对荔枝古树SOD基因家族中剩余的Fe-SOD成员进行了克隆和生物信息学分析，这为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制，以及进一步完善、全面研究Fe-SOD基因在荔枝古树中的时空表达特性、探索其调控途径、作用的分子机理和转基因的抗逆性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采自福州西禅寺的“宋荔”花药诱导而来并每隔20 d继代培养的胚性愈伤组织，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所保存。
1.2 方法
1.2.1 总RNA和DNA的提取及模板的合成 采用Tripure Isolation Reagent（Roche）和改良CTAB法[13]分别提取总RNA和DNA，并分别经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和纯度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒及AP作为接头引物逆转录合成cDNA第一链用于保守区及3′ RACE扩增。而Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成5′ RACE的模板。
1.2.2 引物的设计合成 检索GenBank上登录的与荔枝亲缘关系较近物种的Fe-SOD的同源序列，设计简并引物扩增保守区。根据保守区的测序结果设计3′ RACE和5′ RACE的两条正向和两条反向基因特异引物分别与3′端的通用引物AUAP和5′端的通用引物UPM扩增其3′端和5′端。将所获得的序列片段进行拼接，并根据相近物种的Fe-SOD基因组序列设计ORF框验证及该基因的基因组序列引物。本研究所用引物设计及序列分析都采用DNAMAN6.0软件完成，设计好的引物均委托华大基因公司合成。本研究中使用的引物见表1。
1.2.3 目的片段扩增 基因及基因组序列扩增PCR反应体系为：模板1 μL（5 ng/μL）；上、下游引物各1 μL（10 μmol/L）；DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）12.5 μL；加ddH2O至总体积25 μL。
PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，退火30 s（各退火温度见表1），72 ℃延伸按1 min/kb计算，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。
1.2.4 目的片段的回收、克隆和测序 通过琼脂糖（1%）电泳检测基因PCR扩增产物，割胶回收目的片段。连接pMD18-T，并转化DH5a，挑取阳性克隆子菌液检测合格后送华大基因公司测序。
1.2.5 LcFe-SOD的生物信息学分析 首先使用GSDS软件及DNAMAN6.0软件对基因组序列进行内含子及可变剪接分析。其次，利用ExPASy Protparam预测其基本理化性质；SignalP 4.1 Server和PSORT预测蛋白质信号肽与亚细胞定位情况；蛋白质跨膜区段的预测使用EMBnet TMpred程序；以NCBI-CDS预测分析保守结构域；EMBnet COILS用来预测蛋白卷曲螺旋结构；蛋白质二级及三级结构的预测使用PredictProtein、PSIPRED和SWISS-MODEL在线软件；NetPhos 2.0对蛋白磷酸化位点及分布进行预测；PredictProtein预测蛋白质具体的功能位点；分子系统进化树的构建使用MEGA5.02软件（Neighbor-Joining，邻位相连法，NJ）。
2 结果与分析
2.1 荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD cDNA全长的扩增及测序
LcFe-SOD基因保守区扩增电泳检测结果得到约600 bp的特异性条带（图1-A-1），与预期目的条带大小相符，测序为615 bp。并将测序得到的序列在NCBI的GenBank数据库中在线进行Blast，显示与其它物种的Fe-SOD基因有高度的同源性，其中同龙眼中的DlFSD1b基因仅个别碱基差别。初步推断它们是荔枝LcFe-SOD基因的保守序列。
LcFe-SOD的3′端扩增产物电泳检测结果得到约500 bp的特异性条带（图1-B-3），与预期目的条带大小相符，测序为490 bp。测序结果和软件分析结果表明：所得3′ RACE序列与保守区序列有90 bp的重复片段，并经NCBI上Blast表明，所得序列为荔枝LcFe-SOD基因的3′端序列。
LcFe-SOD的5' RACE的扩增产物为约400 bp的条带（图1-B-5），与预期目的条带大小相符，测序为401 bp。测序和软件分析结果表明：所得序列与保守区序列有120 bp的重复片段。并经NCBI上Blast表明，所得序列为荔枝LcFe-SOD基因的5′端序列。 将实验获得LcFe-SOD基因的5′ RACE序列、保守区序列和3′ RACE序列进行拼接。设计相应ORF验证引物，扩增所得电泳条带如图1-C-6，测序得到长达857 bp，与拼接所得序列一致。因此，获得该基因全长1 285 bp，包含146 bp的5′ UTR，753 bp的ORF及386 bp的3′ UTR（含poly A），将所得序列全长翻译得该序列由250个氨基酸组成。在线进行Blast分析表明所得片段为荔枝LcFe-SOD的基因序列，命名为LcFe-SOD7a（GenBank登入号：KC492109）。
2.2 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因组序列扩增及内含子分析
荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因组序列的PCR扩增图像显示约2 200 bp处得1特异性条带（图1-D-8）。测序得LcFe-SOD7a基因组全长2 284 bp，将该扩增序列与ORF的cDNA序列进行比对，结果显示除了内含子序列外，其它序列完全一致。DNAMEN比对和GSDS软件分析表明，发现该基因由7个内含子和8个外显子组成，其内含子剪接位点符合真核生物GT-AG规则，所得序列结构如图2。外显子的长度依次为72、66、192、172、74、27、24、126 bp，平均长度为94 bp；内含子的长度个别波动相对较大，分别为80、83、91、920、71、101、81 bp，平均长度为204 bp，其最长达920 bp，占该基因组长度的40.28%。将荔枝LcFe-SOD7a的基因组与相应的龙眼基因组比较发现，其同源性高达88.00%。
2.3 荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因可变剪接获得与分析
在对LcFe-SOD7a基因ORF验证的过程中，挑取单克隆子进行菌液PCR鉴定，发现其中1个单克隆子条带上存在差异（图1-C-6），将两管菌液分别测序。测序得1条长857 bp的序列，其序列与拼接的序列完全符合，而另一条长928 bp的序列。将两条基因比对，发现后者仅在中间多出71 bp，其它碱基序列完全相同。将两者和基因组序列比对，所得的928 bp序列插入了完整的第5个内含子，从而多出71 bp，为LcFe-SOD7a基因的1条可变剪接基因，属内含子驻留型[14-15]。将该可变剪接序列进行翻译，其序列有完整的编码框，相对于LcFe-SOD7a的编码序列，其终止密码子提早出现，产生了一个与原蛋白质有很大部分重叠的新的蛋白质。将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b（GenBank登入号：KC492110）。这和龙眼的DlFSD1b基因[15]类似。
2.4 荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因的生物信息学分析
2.4.1 蛋白质的理化性质分析 对荔枝胚性愈伤组织LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因编码蛋白质的理化性质进行分析，初步了解该蛋白的生理生化特性，为探讨其功能和作用的分子机理奠定基础。首先，利用ExPASy ProtParam工具预测结果表明，LcFe-SOD7a蛋白相对分子质量为28 967.1，总原子数为4 053，分子式为C1 331H2 002N344O368S8；该蛋白由19种氨基酸组成，其中以亮氨酸（Leu）含量最丰富，比例达到11.6%，其次是赖氨酸（Lys）占7.2%；该蛋白不稳定系数为33.88；总平均疏水性为-0.435；所带负电的氨基酸（Asp+Glu）和正电的氨基酸（Arg+Lys）数分别为31和28个，理论等电点为6.25；说明该蛋白是稳定的、亲水的偏酸性蛋白质。
进一步使用在线SignalP 4.1软件和亚细胞定位分析表明，LcFe-SOD7a基因编码的蛋白质不属于分泌蛋白，没有典型的信导肽，定位于微体（过氧化物酶体）的可能性是0.640、细胞质的可能性是0.450，这和同源物种龙眼的结论[15]完全一致。最后，对 LcFe-SOD7a蛋白的跨膜区进行的预测结果显示该蛋白含3个跨膜螺旋，由外到内的跨膜结构只有1个，长达18个氨基酸，位于第151～168个残基之间，分值为931；而另两个是由内到外的跨膜结构，分别位于第151～169和215～231个残基之间，第1个分值为660，其中第2个跨膜结构不显著，分值仅34；分值比较分析，推测荔枝LcFe-SOD7a蛋白属跨膜蛋白，其跨膜模型属于N 末端朝外的由外到内进行跨膜的可能性很大。综合上述分析，推测荔枝Lc-SOD7a蛋白主要存在于微体（过氧化物酶体）和细胞质上，通过由外到内的跨膜运动，在荔枝古树的胚性愈伤组织离体保存中发挥着生物学功能。
LcFe-SOD7b蛋白理化性质预测表明：该蛋白不稳定系数为39.40，总平均疏水性为-0.440，带正、负电的氨基酸数分别为22和26个，理论等电点为5.97，说明该蛋白也是稳定的、亲水的酸性蛋白质。定位于微体（过氧化物酶体）和细胞质的可能性分别为0.640和0.450，与LcFe-SOD7a一致，说明该基因的定位信号位点位于该基因的前半部。跨膜分析表明，存在2个跨膜螺旋，跨膜模型也是倾向于N 末端朝外的由外到内进行跨膜。综上分析，两蛋白的理化性质相近，推测两者行使相同的生理生化作用，相辅相成，共同调控着荔枝古树胚性愈伤组织的离体保存。
2.4.2 蛋白质结构特征分析 蛋白结构与其发挥的功能密切相关。首先，通过NCBI-CDS在线分析LcFe-SOD7a保守结构域，该蛋白含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N两个保守结构域，以上两结构域同属PLN02622多结构域（图3）。EMBnet COILS显示，仅在参数window=14的情况下，LcFe-SOD蛋白在氨基酸序列约165～185之间有形成卷曲螺旋结构的可能性。通过PredictProtein在线软件分析其蛋白二级结构，结果表明该蛋白不含普通的二级结构，无NORS区域，主要由51.2%的螺旋（Helix），6.8%的Strand，42%的环（Loop）构成。PSIPRED也表明LcFe-SOD7a蛋白的结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成，其中β折叠和无规则卷曲分布在整个氨基酸序列中。同时利用软件SWISS-MODEL对荔枝LcFe-SOD7a进行三维结构的预测，结果如图4-A。 LcFe-SOD7b的蛋白质结构分析表明：也含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N两个保守结构域，无NORS区域，主要由45.4%的螺旋（Helix），10.6%的Strand，44%的环（Loop）构成，三维结构预测结果如图4-B。从图中也可以看出LcFe-SOD7a结构与LcFe-SOD7b无明显差异，LcFe-SOD7a仅比LcFe-SOD7b多出部分结构。因此推测该可变剪接基因与原基因有着相同的功能，共同调控，协调发挥该基因的应有功能。
2.4.3 氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测 蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后最常见和最重要的一种修饰方式，生物体内的许多生命活动都有参与和调控。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程[16]。采用在线软件NetPhoS 2.0和PredictProtein分析LcFe-SOD7a蛋白潜在的磷酸化位点，有助于了解荔枝LcFe-SOD7a蛋白在翻译后水平上调控方式。 对荔枝LcFe-SOD7a基因编码蛋白通过NetPhoS 2.0预测显示其存在12个潜在的磷酸化位点，如图5所示，分布于整条多肽链中。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点数分别是3、2和7。上述结果表明，LcFe-SOD7a蛋白中磷酸化位点的存在对LcFe-SOD7a蛋白所发挥的功能可能是必须的，调控着荔枝古树胚性愈伤组织的保存。
进一步通过PredictProtein对LcFe-SOD7a蛋白具体所含的磷酸化位点预测结果表明，该蛋白含2个cAMP-和cGMP-dependent蛋白激酶磷酸化位点（CAMP_PHOSPHO_SITE）、2个蛋白激酶C磷酸化位点（PKC_Phospho_site）、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点（CK2_ Phospho_site）、2 个N-酰基化位点（Myristyl）和两个锰铁超氧化物酶信号位点（SOD_MN）（图3）。这些不同的位点可能赋予有不同的酶活性及蛋白结构，而荔枝LcFe-SOD7a蛋白的这些位点组合，从而协同作用产生不同的生物学功能，共同调控荔枝古树胚性愈伤组织的生长保存。
LcFe-SOD7b基因编码蛋白比较分析，NetPhoS 2.0预测显示荔枝存在9个潜在的磷酸化位点，少了3个酪氨酸；PredictProtein显示少了两个锰铁超氧化物酶信号位点（SOD_MN）。
2.5 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因编码的蛋白质同源性和进化分析
同源序列比对结果显示，LcFe-SOD7a翻译的氨基酸序列与同源物种龙眼（Dimocarpus longan ADK70232）的同源性最高达96.4%；与模式植物拟南芥的相似性为71.86%；与藻类植物的莱茵衣藻、苔藓类植物地钱、裸子植物银杏及单子叶植物玉米相似性分别为43.6%、47.47%、48.63%、63.32%，从数据中也体现该基因的进化符合经典的植物进化过程。
对来自14条不同物种的Fe-SOD氨基酸序列采用Mega5.02近邻相接法（Neighbor-Joming，NJ）做进化树分析，进化树中bootstrap值为数字代表，重复检测1 000次。进化树如图6所示，该14条序列分成两个大分支。其中藻类、苔藓类、蕨类和裸子植物为一大分支；被子植物为另一大分支。在被子植物中，单子叶植物和双子叶植物各位一支。从该进化树上可以看出，该基因的进化符合经典的物种进化过程。
3 讨论与结论
3.1 生物信息学初步推测荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因的潜在功能分析
荔枝古树在整个生长发育过程中历经千年必然受到各种逆境的影响，如台风、亚热带的异常高温、辐射、盐碱、病原菌侵染和人为破坏等，这些逆境因素均能导致细胞产生大量的超氧化物阴离子自由基，而大量自由基的积累容易导致植物的早衰。但荔枝古树却历经千年而不衰，其内部活性氧的生成和清除能够千年地维持在动态平衡之中，是值得研究的关键。这种动态平衡的维持主要是通过超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶或非酶类的胡萝卜素（CAR）、抗坏血酸（ASA）和还原性谷胱甘肽（GSH）反应进行系统调节的[17]。其中SOD作为抗氧化系统的第一道防线，必然起着不可替代的作用。对LcFe-SOD7a基因的生物信息学分析表明该基因编码的蛋白是亲水的、稳定的、具有跨膜结构域的偏酸性蛋白质。跨膜蛋白是介导细胞与外界之间的信号传导，处于细胞与外界的交界部位，并执行很多重要的细胞生物学功能，例如，参与细胞膜内外物质交换、能量和信号的传递；构成各种信号分子、激素和其他底物的受体；构成各种离子跨膜的通道，把营养物质和一些无机电解质输入细胞，而将有毒的或无用的代谢产物排出细胞等作用[18-19]。因此，跨膜结构域的存在也为该蛋白行使以上功能提供可能。同时磷酸化位点分析表明，该蛋白存在一些蛋白激酶的磷酸化位点，而大量的研究表明，蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程普遍存在于生物体内，涉及到光合作用、糖代谢、生长发育、基因表达等多种生理过程[20-22]，表明该蛋白可能在上述生理过程中发挥某种作用。因此，若要研究该基因的作用机理，还有待进一步研究SOD酶活性变化、定量表达及功能验证等。
3.2 荔枝古树胚性愈伤组织LcFe-SOD7a基因的可变剪接现象及作用分析
可变剪接被认为是导致蛋白功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物[23]。同时，也是产生基因组规模与生物复杂性之间的矛盾的根源之一[24]。已有实验研究表明，可变剪接在产生受体多样性、控制调节生长发育等方面起决定性作用。在植物界的研究中普遍存在可变剪接现象，龙眼[15]、茄子[25]、番茄[26]、玉米[27]、拟南芥[28]和水稻[29]等都有报道。其中，在SOD基因家族中，可变剪接现象也普遍存在，林玉玲[15]首次对木本植物的SOD进行了较完整的克隆研究，并对其可变剪接进行了分析。本实验室汤燕姗[30]、朱伟玲[31]分别对桃和油柿的SOD研究中，发现Fe-SOD也都存在可变剪接。利用Z.mays EST数据库分析显示FSD和CSD基因存在大量变体序列，而这很可能是由于可变剪接或内含子不同剪接效率造成的[32]。在杨树中hipI-SODC1b基因和hipI-SODC1s基因是hipI-SODC1的2个变体，其中hipI-SODC1b比hipI-SODC1s多出的69 bp正是来自于hipI-SODC的第6个内含子[33]。本实验对该基因研究中所得的一条可变剪接，插入了一个完整的内含子，并使序列提前终止，可以翻译完整的蛋白质，表现了该基因表达多样的蛋白。对该可变剪切基因的理化性质及结构分析表明，两蛋白之间并未存在显著差异，可以推测该可变剪接基因在荔枝古树胚性愈伤组织离体保存过程中与原基因相互协调，有着相似的作用机理。而许珊珊[12]对荔枝的Fe-SOD其它成员的可变剪接分析表明其可变剪接参与细胞活性氧的清除是通过影响信号传递和亚细胞定位来进行的，进而调控其保存中的生长发育。但本实验对该可变剪接蛋白质是否发挥了其它的功能作用，以及其表达量等有待于进一步研究。参考龙眼[15]中该成员基因的研究，共得到该基因的4条可变剪接基因，因此，在荔枝中该基因可能还存在其它的可变剪接现象，又或许正是这种可变剪接的差异对荔枝和龙眼的不同起着一定的影响。 参考文献
[1] Bubliy O， Loeschcke V. Correlated responses to selection for stress resistance and longevity in a laboratory population of Drosophila melanogaster[J]. Journal of Evolutionary Biology， 2005， 18（4）： 789-803.
[2] Van Camp W， Capiau K， Van Montagu M， et al. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts[J]. Plant physiology， 1996， 112（4）： 1 703-1 714.
[3] Tsugane K， Kobayashi K， Niwa Y， et al. A recessive Arabidopsis mutant that grows photoautotrophically under salt stress shows enhanced active oxygen detoxification[J]. The Plant Cell Online， 1999， 11（7）： 1 195-1 206.
[4] McKersie B D， Chen Y， de Beus M， et al. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa（Medicago sativa L.）[J]. Plant physiology， 1993， 103（4）： 1 155-1 163.
[5] Perl A， Perl-Treves R， Galili S， et al. Enhanced oxidative-stress defense in transgenic potato expressing tomato Cu， Zn superoxide dismutases[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics， 1993， 85（5）： 568-576.
[6] Tanaka Y， Hibino T， Hayashi Y， et al. Salt tolerance of transgenic rice overexpressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts[J]. Plant Science， 1999， 148（2）： 131-138.
[7] McKersie B D， Murnaghan J， Jones K S， et al. Iron-superoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance[J]. Plant physiology， 2000， 122（4）： 1 427-1 438.
[8] 郁万文， 曹福亮， 汪贵斌，等. 银杏抗氧化酶系统对短期梯度变温的响应[J]. 江西农业大学学报， 2008， 30（2）： 252-255.
[9] Van Breusegem F， Slooten L， Stassart J M， et al. Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize[J]. Plant and cell physiology， 1999， 40（5）： 515-523.
[10] Van Camp W， Bowler C， Villarroel R， et al. Characterization of iron superoxide dismutase cDNAs from plants obtained by genetic complementation in Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1990， 87（24）： 9 903-9 907.
[11] 赖钟雄， 李焕苓. 古树名木基因资源的挖掘与利用[J]. 国土绿化， 2007（5）： 6-7.
[12] 许珊珊. 福州荔枝古树离体种质保存及抗性基因SOD的克隆与表达[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[13] 丁晓东， 吕柳新. 从顽拗植物荔枝中提取基因组DNA技术的研究[J]. 应用与环境生物学报， 2000， 6（2）： 142-145.
[14] Werneke J M， Chatfield J M， Ogren W L. Alternative mRNA splicing generates the two ribulosebisphosphate carboxylase/ oxygenase activase polypeptides in spinach and Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online， 1989， 1（8）： 815-825. [15] 林玉玲. 龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2011.
[16] 姜 铮， 王 芳， 何 湘， 等. 蛋白质磷酸化修饰的研究进展[J]. 生物技术通讯， 2009（2）： 233-237.
[17] Gupta S D， Datta S. Antioxidant enzyme activities during in vitro morphogenesis of gladiolus and the effect of application of antioxidants on plant regeneration[J]. Biologia Plantarum， 2003， 47（2）： 179-183.
[18] Rinalducci S， Zolia L， Timperio A M. Photosynthetic membrane proteomics[J]. Plant molecules： basic and applied research， 2006， 5： 99.
[19] Aldape M J， Elmer A M， Chao W S， et al. Identification and characterization of a sucrose transporter isolated from the developing cotyledons of soybean[J]. Archives of biochemistry and biophysics， 2003， 409（2）： 243-250.
[20] Gilbert C， Gaudry M， Naccache P H. Rapid priming of calcium mobilization and superoxide anion production in human neutrophils by substimulatory concentrations of phorbol esters： a novel role for protein kinase C and tyrosine phosphorylation in the up-modulation of signal transduction[J]. Cellular signalling， 1992， 4（5）： 511-523.
[21] Ahmed K， Davis A T， Wang H， et al. Significance of protein kinase CK2 nuclear signaling in neoplasia[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2000， 79（S35）： 130-135.
[22] Lin R， Hiscott J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity[J]. Molecular and cellular biochemistry， 1999， 191（1-2）： 169-180.
[23] Roberts G C， Smith C W. Alternative splicing： combinatorial output from the genome[J]. Current opinion in chemical biology， 2002， 6（3）： 375-383.
[24] Harrison P M， Kumar A， Lang N， et al. A question of size： the eukaryotic proteome and the problems in defining it[J]. Nucleic acids research， 2002， 30（5）： 1 083-1 090.
[25] 罗 艳， 王 瑛. 茄子SmU2AF 65基因的可变剪接[J]. 遗传， 2008， 30（11）： 1 499-1 505.
[26] 宋晓毅， 徐幼平， 张志新， 等. 8个番茄ACE全长cDNA序列的克隆和分析[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2009， 35（3）： 249-254.
[27] 王存芳， 李记园， 王茅雁. 玉米ZmCBL5-2基因的克隆及其转化拟南芥[J]. 内蒙古农业大学学报： 自然科学版， 2011， 32（1）： 162-166.
[28] Iida K， Seki M， Sakurai T， et al. Genome-wide analysis of alternative pre-mRNA splicing in Arabidopsis thaliana based on full-length cDNA sequences[J]. Nucleic acids research， 2004， 32（17）： 5 096-5 103.
[29] 康海岐， 申国安， 程在全， 等. 水稻ⅡB型拓扑异构酶OsSpo11基因的cDNA克隆， 表达谱分析及其可变剪接的检测[J]. 中山大学学报： 自然科学版， 2008， 47（1）： 88-92.
[30] 汤燕姗. 桃梨离体保存及桃SOD基因的克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[31] 朱伟玲. 福建柿子种质资源离体保存及其试管苗叶片SOD基因克隆[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.
[32] Katyshev A， Rogozin I， Konstantinov Yu M. identification of new superoxide dismutase transcripts in plants by est analysis： alternative polyadenylation and splicing events[J]. Computational structural and functional genomics and transcriptomics， 2006.
[33] Srivastava V， Srivastava M K， Chibani K， et al. Alternative splicing studies of the reactive oxygen species gene network in Populus reveal two isoforms of high-isoelectric-point superoxide dismutase[J]. Plant physiology， 2009， 149（4）： 1 848-1 859.
责任编辑：沈德发