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摘要[目的]采用正交试验法对异叶青兰中黄酮和多糖进行连续提取。[方法]以提取温度、料液比、提取时间、提取次数为因素，用正交试验法优化黄酮提取工艺;用提取黄酮后的异叶青兰滤渣，通过水提、醇沉的方法提取多糖。[结果]异叶青兰中黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度为70%，料液比1∶50，提取时间2 h，提取2次;用70%乙醇提取黄酮后的滤渣提取的多糖含量最高。[结论]该试验结果可靠，方法简便，最佳条件适合批量生产该药材的提取。
关键词异叶青兰;黄酮;多糖;连续工艺
中图分类号R284.2文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）02-0162-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.049
异叶青兰（Dracocephalum heterophyllum Benth.）又名白花夏枯草，系唇形科青兰属多年生草本植物，维吾尔语中称“阿勒黑力龙普勒马占居力”[1]，是维吾尔族的民间传统药。异叶青兰主要分布于青海、甘肃、新疆、西藏及四川等地[2]，目前，其野生资源已逐渐减少。异叶青兰含有多种生物活性成分，如挥发油、黄酮、萜类、多糖等，主要用于治疗止咳平喘[3]、口腔溃疡、热性病头痛、眼翳、黄疸性发热、肝热、高血压等[4]。目前对异叶青兰的研究多集中在单一提取黄酮[5-6]、挥发油[7-8]、多糖[9]等活性成分，对复合提取异叶青兰中黄酮和多糖成分的研究较少。因此，该研究以异叶青兰为原料，建立异叶青兰中黄酮和多糖这2种有效成分的复合提取工艺，为新疆异叶青兰中黄酮和多糖的研究与开发利用奠定基础，对减少资源浪费、有效利用新疆特殊植物资源具有非常重要的理论意义和应用价值。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料。异叶青兰采自新疆喀什地区，经鉴定为植
物异叶青兰干燥地上部分。
1.1.2仪器。Spectrumlab 54紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）;Buchi Rotavapor旋转蒸发仪（瑞士BuchiLabotechnikAG）;RE52-05型旋转薄膜蒸发器（上海亞荣生化仪器厂）;SHZ-C型循环水式多用真空泵（巩义市英欲予华仪器）;
TDL-5型台式离心机（上海安亭科技仪器厂）;真空ALPHRI-ZLD冷冻干燥机（德国Christ公司）;BSZ10电子分析天平（德国SartoriuS公司）;电子天平（上海精密仪器科学有限公司）;粉碎机（温岭市大众电器厂）。
1.1.3试剂。芦丁标准品购自北京中科三捷生物科技有限公司;葡萄糖标准品购自上海士锋生物科技有限公司;乙醇、氢氧化钙、浓硫酸、苯酚、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、丙酮等试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1黄酮和多糖的连续提取工艺流程。工艺流程见图1。
1.2.2黄酮和多糖含量的测定。
黄酮含量的测定以芦丁为标准，采用硝酸铝显色法显色，测定吸光度，计算黄酮的提取量[10-11];多糖含量的测定以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法，测定吸光度，计算多糖的提取量[10]。
1.2.3单因素试验。分别以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数进行单因素试验，研究其对异叶青兰中黄酮提取量的影响。
1.2.3.1乙醇浓度。
取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定料液比1∶40，提取时间1.5 h，提取次数1次，在乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的条件下进行提取。
1.2.3.2料液比。取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，提取时间1.5 h，提取次数1次，在料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 （g/mL）的条件下进行提取。
1.2.3.3回流提取时间。
取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取次数1次，在回流时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的条件下进行提取。
1.2.3.4提取次数。取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取时间1.5 h，在提取次数分别为1、2、3、4、5 次的条件下进行提取。
1.2.4正交试验。在单因素试验基础上确定其中主要4个影响因素，然后设计四因素三水平L9（34）的正交试验，优选最佳工艺条件。
1.2.5多糖的提取。
取正交试验中提取黄酮后的异叶青兰滤渣，40 ℃恒温干燥滤渣后加入40 mL蒸馏水回流提取1 h，过滤，滤渣重复上述操作1次，合并滤液浓缩至适量，加入无水乙醇使乙醇浓度为80%，放置12 h后抽滤，沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮反复洗涤2次，沉淀物用蒸馏水溶解至10 mL即得多糖粗提液。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对黄酮提取量的影响。由图2可知，随着乙醇浓度的增加，黄酮提取量逐步增加，当乙醇浓度为70%时黄酮提取量最高，而后随着乙醇浓度的增加黄酮提取量降低，其原因可能是乙醇浓度达到一定值后，随着乙醇浓度的增大，黄酮类化合物溶解度降低。与此同时，一些醇溶性杂质和亲酯性强的成分溶出量增加，它们与黄酮类化合物竞争同乙醇∶水分子的结合，导致黄酮类化合物提取量下降[6]。故选取乙醇浓度70%较好。
2.1.2料液比对黄酮提取量的影响。由图3可知，随着料液比的增加，黄酮提取量逐渐增加，在料液比为1∶40后黄酮提取量增加幅度不大，为不造成资源浪费，选择料液比1∶40较合适。 2.1.3回流提取时间对黄酮提取量的影响。由图4可知，在回流时间为0.5～1.5 h，随着时间的延长，黄酮提取量增加明显，在回流时间为1.5～2.5 h，随着时间的延长，黄酮提取量增加较小，当回流时间为2.5 h时，提取量最高。但考虑到若回流提取时间太长，部分乙醇挥发，影响黄酮的提取，故选择提取时间1.5 h较合适。
2.1.4提取次数对黄酮提取量的影响。
从图5可知，黄酮提取量随着提取次数的增加而提高，提取2次以后，随着提取次数的增加，黄酮提取量的提高程度较小，考虑到增加提取次数，既消耗时间，又增加乙醇的用量，增加成本，在不明显影响黄酮提取量的情况下，选择提取次数2次较合适。
2.2正交试验
通过单因素试验对乙醇浓度、料液比、回流提取时间和提取次数进行初步筛选，为分析各参数对黄酮提取量影响的主次因素，获得最佳提取工艺，进行四因素三水平L9（34）正交试验（表1）。
对正交试验数据进行统计分析可知，级差最大的为A因素，其次为B因素，再次是C因素和D因素，说明在异叶青兰的乙醇回流提取中，对黄酮提取量影响最大的为乙醇浓度，其次是料液比、提取时间和提取次数。试验结果表明，乙醇回流提取异叶青兰最佳的提取工艺为A3B3C3D2，即乙醇浓度为70%，料液比1∶50，提取时间2.0 h，提取次数2次（表2）。
2.3异叶青兰中多糖提取量
将正交试验中回流提取黄酮后的异叶青兰滤渣在40 ℃恒温干燥后加入40 mL蒸馏水回流提取1 h，并重复提取1次，合并滤液浓缩至适量，加入无水乙醇使乙醇含量为80%，放置12 h后抽滤，沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮反复洗涤2次，沉淀物用蒸馏水溶解至10 mL测定多糖含量。异叶青兰中多糖含量在5.12 mg/g左右，并且随着提取黄酮所用乙醇浓度的增大，多糖提取量增加，其原因可能是多糖易溶于水，乙醇浓度低时含水量多，异叶青兰中少部分多糖溶于乙醇溶液中，造成多糖提取量的降低。
3结论
以上单因素试验和正交试验探讨了乙醇回流提取异叶青兰中黄酮的最佳提取工艺，即：乙醇浓度为70%，料液比1∶50，提取时间2 h，提取次数2次。提取黄酮后的滤渣干燥后可以继续用蒸馏水提取多糖，在提取黄酮所用乙醇浓度为70 %时多糖的损失较小，提取量较多。另外，在整个试验过程中，黄酮提取量较多，多糖提取量较少，其原因可能是异叶青兰中黄酮含量多，多糖含量少。
参考文献
[1] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2010：358-361.
[2] 任爱梅.异叶青兰化学成分及抑菌活性研究[J].中草药，2011，42（4）：664-667.
[3] 袁勇，曹伟.异叶青兰提取物平喘止咳作用的实验研究[J].农垦医学，2013，35（1）：5-7.
[4] 何雯，邬利娅·伊明，司丽君，等.异叶青兰总黄酮对高血压大鼠血管内皮的保护作用[J].中国医院药学杂志，2013，33（15）：1226-1228.
[5] 張德，韩海洪，李有忠.藏药异叶青兰的黄酮成分[J].青海师范大学学报（自然科学版），1997（3）：47-50.
[6] 余江柳，艾来提·苏里坦.异叶青兰总黄酮提取工艺的研究[J].生物技术，2007，17（5）：79-81.
[7] 陆曼，田暄.异叶青兰挥发油成分分析[J].药学学报，1999，34（12）：925- 927.
[8] 杨平荣，文娟，金赟，等.异叶青兰提取物抗病毒作用及挥发油成分分析[J].中国新药杂志，2015，24（6）：669-675.
[9] 李莉，徐杨，马志刚.甘肃青兰属植物中多糖的含量测定[J].时珍国医国药，2009，20（3）：663-664.
[10] 贾福怀，黄贝梅，涂宏建，等.不同提取方法测定桑叶黄酮和多糖的含量[J].安徽农业科学，2017，45（10）：124-125，175.
[11] 李众飞.黄瓜藤中黄酮的提取工艺研究[J].内蒙古农业科技，2005（1）：20-21.
关键词异叶青兰;黄酮;多糖;连续工艺
中图分类号R284.2文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）02-0162-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.049
异叶青兰（Dracocephalum heterophyllum Benth.）又名白花夏枯草，系唇形科青兰属多年生草本植物，维吾尔语中称“阿勒黑力龙普勒马占居力”[1]，是维吾尔族的民间传统药。异叶青兰主要分布于青海、甘肃、新疆、西藏及四川等地[2]，目前，其野生资源已逐渐减少。异叶青兰含有多种生物活性成分，如挥发油、黄酮、萜类、多糖等，主要用于治疗止咳平喘[3]、口腔溃疡、热性病头痛、眼翳、黄疸性发热、肝热、高血压等[4]。目前对异叶青兰的研究多集中在单一提取黄酮[5-6]、挥发油[7-8]、多糖[9]等活性成分，对复合提取异叶青兰中黄酮和多糖成分的研究较少。因此，该研究以异叶青兰为原料，建立异叶青兰中黄酮和多糖这2种有效成分的复合提取工艺，为新疆异叶青兰中黄酮和多糖的研究与开发利用奠定基础，对减少资源浪费、有效利用新疆特殊植物资源具有非常重要的理论意义和应用价值。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料。异叶青兰采自新疆喀什地区，经鉴定为植
物异叶青兰干燥地上部分。
1.1.2仪器。Spectrumlab 54紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）;Buchi Rotavapor旋转蒸发仪（瑞士BuchiLabotechnikAG）;RE52-05型旋转薄膜蒸发器（上海亞荣生化仪器厂）;SHZ-C型循环水式多用真空泵（巩义市英欲予华仪器）;
TDL-5型台式离心机（上海安亭科技仪器厂）;真空ALPHRI-ZLD冷冻干燥机（德国Christ公司）;BSZ10电子分析天平（德国SartoriuS公司）;电子天平（上海精密仪器科学有限公司）;粉碎机（温岭市大众电器厂）。
1.1.3试剂。芦丁标准品购自北京中科三捷生物科技有限公司;葡萄糖标准品购自上海士锋生物科技有限公司;乙醇、氢氧化钙、浓硫酸、苯酚、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、丙酮等试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1黄酮和多糖的连续提取工艺流程。工艺流程见图1。
1.2.2黄酮和多糖含量的测定。
黄酮含量的测定以芦丁为标准，采用硝酸铝显色法显色，测定吸光度，计算黄酮的提取量[10-11];多糖含量的测定以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法，测定吸光度，计算多糖的提取量[10]。
1.2.3单因素试验。分别以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数进行单因素试验，研究其对异叶青兰中黄酮提取量的影响。
1.2.3.1乙醇浓度。
取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定料液比1∶40，提取时间1.5 h，提取次数1次，在乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的条件下进行提取。
1.2.3.2料液比。取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，提取时间1.5 h，提取次数1次，在料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 （g/mL）的条件下进行提取。
1.2.3.3回流提取时间。
取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取次数1次，在回流时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的条件下进行提取。
1.2.3.4提取次数。取2.0 g干燥的粉碎过筛的异叶青兰置于圆底烧瓶中，固定乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取时间1.5 h，在提取次数分别为1、2、3、4、5 次的条件下进行提取。
1.2.4正交试验。在单因素试验基础上确定其中主要4个影响因素，然后设计四因素三水平L9（34）的正交试验，优选最佳工艺条件。
1.2.5多糖的提取。
取正交试验中提取黄酮后的异叶青兰滤渣，40 ℃恒温干燥滤渣后加入40 mL蒸馏水回流提取1 h，过滤，滤渣重复上述操作1次，合并滤液浓缩至适量，加入无水乙醇使乙醇浓度为80%，放置12 h后抽滤，沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮反复洗涤2次，沉淀物用蒸馏水溶解至10 mL即得多糖粗提液。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对黄酮提取量的影响。由图2可知，随着乙醇浓度的增加，黄酮提取量逐步增加，当乙醇浓度为70%时黄酮提取量最高，而后随着乙醇浓度的增加黄酮提取量降低，其原因可能是乙醇浓度达到一定值后，随着乙醇浓度的增大，黄酮类化合物溶解度降低。与此同时，一些醇溶性杂质和亲酯性强的成分溶出量增加，它们与黄酮类化合物竞争同乙醇∶水分子的结合，导致黄酮类化合物提取量下降[6]。故选取乙醇浓度70%较好。
2.1.2料液比对黄酮提取量的影响。由图3可知，随着料液比的增加，黄酮提取量逐渐增加，在料液比为1∶40后黄酮提取量增加幅度不大，为不造成资源浪费，选择料液比1∶40较合适。 2.1.3回流提取时间对黄酮提取量的影响。由图4可知，在回流时间为0.5～1.5 h，随着时间的延长，黄酮提取量增加明显，在回流时间为1.5～2.5 h，随着时间的延长，黄酮提取量增加较小，当回流时间为2.5 h时，提取量最高。但考虑到若回流提取时间太长，部分乙醇挥发，影响黄酮的提取，故选择提取时间1.5 h较合适。
2.1.4提取次数对黄酮提取量的影响。
从图5可知，黄酮提取量随着提取次数的增加而提高，提取2次以后，随着提取次数的增加，黄酮提取量的提高程度较小，考虑到增加提取次数，既消耗时间，又增加乙醇的用量，增加成本，在不明显影响黄酮提取量的情况下，选择提取次数2次较合适。
2.2正交试验
通过单因素试验对乙醇浓度、料液比、回流提取时间和提取次数进行初步筛选，为分析各参数对黄酮提取量影响的主次因素，获得最佳提取工艺，进行四因素三水平L9（34）正交试验（表1）。
对正交试验数据进行统计分析可知，级差最大的为A因素，其次为B因素，再次是C因素和D因素，说明在异叶青兰的乙醇回流提取中，对黄酮提取量影响最大的为乙醇浓度，其次是料液比、提取时间和提取次数。试验结果表明，乙醇回流提取异叶青兰最佳的提取工艺为A3B3C3D2，即乙醇浓度为70%，料液比1∶50，提取时间2.0 h，提取次数2次（表2）。
2.3异叶青兰中多糖提取量
将正交试验中回流提取黄酮后的异叶青兰滤渣在40 ℃恒温干燥后加入40 mL蒸馏水回流提取1 h，并重复提取1次，合并滤液浓缩至适量，加入无水乙醇使乙醇含量为80%，放置12 h后抽滤，沉淀依次用无水乙醇、乙醚、丙酮反复洗涤2次，沉淀物用蒸馏水溶解至10 mL测定多糖含量。异叶青兰中多糖含量在5.12 mg/g左右，并且随着提取黄酮所用乙醇浓度的增大，多糖提取量增加，其原因可能是多糖易溶于水，乙醇浓度低时含水量多，异叶青兰中少部分多糖溶于乙醇溶液中，造成多糖提取量的降低。
3结论
以上单因素试验和正交试验探讨了乙醇回流提取异叶青兰中黄酮的最佳提取工艺，即：乙醇浓度为70%，料液比1∶50，提取时间2 h，提取次数2次。提取黄酮后的滤渣干燥后可以继续用蒸馏水提取多糖，在提取黄酮所用乙醇浓度为70 %时多糖的损失较小，提取量较多。另外，在整个试验过程中，黄酮提取量较多，多糖提取量较少，其原因可能是异叶青兰中黄酮含量多，多糖含量少。
参考文献
[1] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2010：358-361.
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[8] 杨平荣，文娟，金赟，等.异叶青兰提取物抗病毒作用及挥发油成分分析[J].中国新药杂志，2015，24（6）：669-675.
[9] 李莉，徐杨，马志刚.甘肃青兰属植物中多糖的含量测定[J].时珍国医国药，2009，20（3）：663-664.
[10] 贾福怀，黄贝梅，涂宏建，等.不同提取方法测定桑叶黄酮和多糖的含量[J].安徽农业科学，2017，45（10）：124-125，175.
[11] 李众飞.黄瓜藤中黄酮的提取工艺研究[J].内蒙古农业科技，2005（1）：20-21.