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背景:目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法,后两种方法可获得较为纯化的骨髓间充质干细胞,但对细胞活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性。目的:观察不同分离方法、培养条件下,兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的变化。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2006-01/2007-06在中国医科大学附属盛京医院感染病实验室完成。材料:日本雄性大耳白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供。Mesen Cult干细胞培养基为Vancouver BC公司产品,DMEM/F12(1∶1)培养基、LG-DMEM培养基均为Hyclone公司产品。方法:无菌抽取兔髂前上棘骨髓,采取两种方法分离骨髓间充质干细胞。全骨髓贴壁分离法是将骨髓液注入等体积的Hanks液中,4℃1000r/min离心5min,弃上清,用Hanks液重复洗涤。Percoll密度梯度分离法是将相当于2倍骨髓液体积的1.073g/mL Percoll分离液加入15mL无菌离心管内,再将抗凝的骨髓沿管壁缓慢加至分离液面上,4℃800r/min离心30min,吸取分离液面上的白色云雾状单个核细胞层,用无血清L-DMEM培养液冲洗。将分离的骨髓间充质干细胞浓度调整为1×106,设立3组,分别加入MesenCult干细胞培养基、DMEM/F12培养基、L-DMEM培养基,各组培养基中均含有20%的胎牛血清、100u/mL青霉素、100u/mL链霉素,于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。主要观察指标:不同分离方法、培养条件对细胞形态、生长特征、增殖的影响,细胞超微结构变化,传代后冻存复苏情况。结果:全骨髓贴壁分离法1周后可见少许贴壁细胞伸出伪足,10～12d形成散在细胞集落,16～18d融合成单层;Percoll密度梯度分离法培养1～2d后可见部分细胞贴壁,5～7d形成散在细胞集落,2周后融合成单层并铺满平底。不同培养条件下的第3代骨髓间充质干细胞,MesenCult组细胞增殖能力、贴壁率、BrdU标记指数均略优于DMEM/F12组、LG-DMEM组,但差异无显著性意义(F=0.179,P>0.05;F=0.098,P>0.05;χ2=0.39,P>0.05)。透射电镜下可见核仁,细胞器少,为低分化的幼稚细胞。复苏第9代冻存的细胞,4h后贴壁率约60%,细胞增长活跃。结论:Percoll密度梯度法和全骨髓贴壁法分离的兔骨髓间充质干细胞,前者可获得较均匀一致的单核细胞,在细胞增殖、清除造血细胞干扰等方面明显优于后者;MesenCult、DMEM/F12、LG-DMEM培养液均适用于兔骨髓间充质干细胞的培养;细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。