【摘 要】
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目的 利用重组腺病毒载体将生长分化因子5(growth and differentiation factor 5,GDF-5)基因导入hBMSCs,研究GDF-5基因的表达和对hBMSCs成骨分化的影响. 方法 将重组腺病毒GD
【机 构】
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四川大学华两医院骨科,成都,610041;四川大学华两医院生物治疗国家重点实验室,成都,610041
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目的 利用重组腺病毒载体将生长分化因子5(growth and differentiation factor 5,GDF-5)基因导入hBMSCs,研究GDF-5基因的表达和对hBMSCs成骨分化的影响. 方法 将重组腺病毒GDF-5(adenovirus GDF-5,Ad-GDF-5)[含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记]和空载腺病毒Ad-GFP进行扩增并测定滴度,并以不同滴度两种病毒感染第3代hBMSCs,干预后2 d荧光显微镜下观察GFP表达情况,RT-PCR检测GDF-5在hBMSCs中的表达.取第3代贴壁hBMSCs随机分为4组:实验组(GDF-5基因转染组)、成骨诱导组、空载组和对照组.于干预后不同时间行倒置相差显微镜观察、荧光显微镜观察、荧光定量RT-PCR、免疫荧光染色和von Kossa染色检测细胞分化情况. 结果 Ad-GDF-5滴度为1.0 × 109 pfu/mL,Ad-GFP滴度为1.2×109pfu/mL.Ad-GDF-5及Ad-GFP均能对hBMSCs有效感染,并使其表达目的 基因和GFP基因.干预后1～7 d实验组和成骨诱导组hBMSCs细胞形态及生长方式向成骨细胞转化,而对照组和空载组hBMSCs仍保持原有形态及生长方式.荧光定量RT-PCR检测示,干预后4 d实验组GDF-5基因表达明显高于其余各组(P<0.05);实验组和成骨诱导组ALP、Col Ⅰ、骨钙素基因表达均高于空载组和对照组(P<0.05),成骨诱导组Col Ⅰ基因表达高于实验组(P<0.05).干预后4 d,免疫荧光染色示成骨诱导组和实验组细胞表达并分泌Col Ⅰ,空载组和对照组细胞未见Col Ⅰ表达.干预后10 d,成骨诱导组和实验组细胞von Kossa染色为阳性,对照组和空载组为阴性. 结论 GDF.5基因可通过腺病毒载体导入hBMSCs稳定表达,并促使其成骨分化,为进一步研究这种转基因hBMSCs修复骨组织奠定了基础.
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