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摘要：筛选与抗赤星病位点紧密关联的分子标记，为烟草分子标记辅助育种提供依据。利用404对SSR引物对96份烟草种质材料进行基因组扫描，分析其群体结构，并进行烟草赤星病抗性关联分析。结果表明，在两种不同环境条件下共检测到38个与烟草赤星病抗性显著关联的分子标记（P≤0.01），其中标记PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727关联强度较大或在不同环境条件下被重复关联到，分别位于6号、8号、9号、19号、3号和23号烟草连锁群上。关联到的分子标记可以用于烟草抗赤星病育种的辅助选择。
关键词：烟草；赤星病；SSR；关联分析
中图分类号：S435.72文章编号：1007-5119（2017）01-0068-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.012
Abstract：In order to screen for SSR markers associated with tobacco brown spot resistant genes and to provide useful information for breeders， 404 SSR markers were used to scan polymorphism among a population containing 96 tobacco germplasms in this study. Population structure was analyzed and association analysis between disease index and SSR markers were performed using TASSEL 2.1. 38 SSR markers were identified as being associated with resistant genes at the level of P≤0.01. The resultsalso indicated that PT60236， PT50668， PT50176， PT53770， PT60080 and PT50727 were tightly associated with resistant genes.These SSR markers were located in the 6th， 8th， 9th， 19th， 3th， 23th tobacco linkage group respectively. The markers identified in this study are useful in molecular marker assisted selection in tobacco breeding programs for brown spotresistance.
Keywords： tobacco；tobacco brown spot； SSR； association analysis
烟草是我国重要的经济作物，烟草赤星病是由链格孢菌[Alter aria alternata （Fries）Keissler]引起的烟叶成熟期病害，赤星病的发生可影响烟叶产量和品质，造成经济损失[1-3]。培育抗赤星病烟草品种是防治赤星病的重要有效方法。
Dobhal等[4]研究发现烟草对赤星病抗性为部分显性，受多基因控制。郭永峰等[5]研究表明烟草赤星病抗病基因的加性效应和显性效应同时存在，以加性效应为主。蒋彩虹等[6]研究发现一个与抗赤星病基因连锁的SSR标记连锁群，位于M号连锁群上，该连锁群包括12个SSR标记，全长181.5 cM，平均间距15.1 cM。Tong等[7]配制净叶黄和长脖黄杂交组合，利用SSR标记对F2群体进行抗性QTL分析，定位到3个连锁群，分别位于2号、3号和5号连锁群上。目前烟草抗赤星病QTL研究不多[8]，与赤星病抗性相关的标记数目较少且定位到的抗性连锁群不一致。Bindler等[9]发表一张烟草高密度遗传连锁图谱，其SSR引物覆盖烟草全基因组24个连锁群，可以充分发掘与赤星病抗性相關的标记。
目前有关烟草重要性状关联分析的报道主要集中在株高、叶数等基本农艺性状上[10]。烟草赤星病抗性的全基因组关联分析尚未见报道。本研究利用生产上常用的96份烤烟种质组成的自然群体和SSR分子标记，对烟草赤星病抗性进行标记-性状关联分析，筛选与抗性显著关联标记位点，为开展烟草赤星病抗性分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
中国烟草种质资源库提供供试群体材料，供试群体由表型变异丰富、遗传多样性较高的96份烤烟种质组成，包括35份国外引进种质和61份国内种质（表1）。
2015年2月，供试材料分别种植于诸城试验基地的自然病圃（T1环境）和即墨试验基地的自然病圃（T2环境）。随机区组设计，株距0.5 m，行距1.2 m，每个材料种植1行，每行10棵，重复2次。
1.2赤星病病情调查
烟苗移栽大田后60 d左右，调查供试材料的赤星病发病情况。根据叶片赤星病病斑的有无和大小，划分0级、1级、3级、5级、7级和9级。依据病级计算病情指数（the disease index，DI），DI =100×Σ（病级×该病级株数）/（总株数×最高病级）。
1.3 PCR扩增和电泳检测
在烟草旺长期，从同一品种株系中选取5株典型植株，混合取嫩叶，提取DNA。依据Bindler 2011年公布的烟草全基因组高密度遗传连锁图谱筛选出404对具有多态性的SSR引物，404对引物覆盖烟草全基因组24个连锁群，对供试群体DNA进行PCR扩增。扩增程序为95 ℃ 3 min；95 ℃30s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35次循环；72℃10 min。利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。参照任民等改进的银染方法进行显影[11]。 1.4数据统计分析
利用 Microsoft Excel 97—2003 统计供试群体赤星病病情指数（DI）；采用软件Structure 2.3.4[12]进行群体结构分析：K值设为1～7，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）开始时不作数迭代（length ofbum-in Period）设为100000，Number of MCMC Peps after burn-in设为100000，△K取最大值时，确定类群数目；应用软件Tassel 2.1的混合线性模型（MLM，Mixed Linear Model）[13]，代入群体结构的Q值、表型数据和SSR标记分型数据进行关联分析。
2结果
2.1供试群体病情指数分析
两种环境下供试群体的病情指数见图1。T1环境中，供试材料的病情指数相对集中，主要分布在50～75；T2环境中，供试材料的病情指数主要分布在50～62.5。两种环境下群体病情指数的相关性r=0.60，说明两个群体的病情指数存在中度相关。对供试群体的病情指数统计分析显示，T1环境下偏度系数Skewness=0.144，峰度系数Kurtosis=-0.327，两个系数均小于1，可认为其频率符合正态分布；T2环境下，偏度系数Skewness=-0.544，峰度系数Kurtosis=-0.161，两个系数均小于1，其频率同样符合正态分布。
分析供试群体的病情指数可以发现NC82、C151、革新5号等14份种质材料在两个环境下都表现为高度感病；T1环境下，单育二号表现为高度抗病，净叶黄、潘圆黄等21份种质表现为抗病；T2环境下，单育二号、净叶黄、潘圆黄等13份种质
表现为高度抗病，RG17、9201等11份种质表现为抗病；两个试验点均未发现对赤星病免疫的种质材料。
2.2 供试群体遗传结构分析
供试群体的遗传结构分析结果见图2，当K=3时，△K取得最大值，即表明供试群体可分为3个亚群，与供试群体的系谱来源基本一致。
2.3SSR标记-表型性状关联分析
404对具有多态性的SSR标记和群体病情指数的关联分析结果见表2。在显著水平（P≤0.01）下，T1环境中共关联到29个标记位点，分布在13个连锁群上；T2环境中关联到13个标记位点，分布在9个连锁群上。其中PT60236、PT50668、PT50176、PT53770在T1和T2环境下均被关联到。
在极显著水平（P≤0.001）下，T1环境中关联到10个标记位点，分布在3号、5号、8号、16号、17号、19号、23号、24号连锁群上；T2环境中关联到3个标记位点，分布在9号、17号、19号连锁群上。其中PT53770位点在两个环境下都被关联到，位于19号连锁群上。
综合两种环境下的关联结果：PT60236、PT50668、PT50176、PT53770被重复关联到，分别位于6号、8号、9号和19号连锁群（图3）上；PT60080和PT50727只在T1环境下被关联到，两个标记的P值分别为1.6923×10-5和1.6945×10-5，关联强度较大，分别位于3号和23号连锁群（图3）。这些被重复关联到或关联强度较大的位点，可用于烟草赤星病抗性标记辅助选择育种。
3讨论
烟草赤星病是烟叶生产的主要真菌性病害，对烟叶生产造成严重危害，培育抗性品种是最有效的措施之一。在本研究比较了96份生产上常用的烤烟品种（系）在不同环境条件下的赤星病抗性表现，得到以下几个结论：第一，不同烤烟品种间赤星病抗性存在很大的遗传变异，病情指数从1.23到100，平均61.47，两个环境下的病情指数均符合正态分布，表明烟草对赤星病抗性属于数量性状，受多基因控制，易受环境影响。第二，在连续两个环境条件下，净叶黄、单育二号、潘园黄等材料的赤星病抗性都鉴定为抗病，而这几个材料都具有明显的系谱关系，这说明在烟草种质中存在控制赤星病抗性的主效QTL。定位赤星病抗性基因所在染色体位置，发掘与之紧密连锁的分子标记，对开展烟草赤星病抗性改良工作具有可行性和重要性。
目前数量性状定位研究主要采用的方法为连锁分析方法和关联分析方法。连锁分析以亲本杂交后代的分离群体为研究对象，所以研究局限于两个亲本的遗传背景，且配制分离群体的过程中需要多次的自交和杂交，研究周期较长。而关联分析方法可利用自然群体，具有节约群体构建所需时间和检测相同位点上的多个不同等位基因变异等优势，已在各种主要作物上广泛应用[14-16]。由于普通烟草属于异源四倍体，基因组约4.5Gb，可用的分子标记较少。烟草重要性状定位研究主要集中在连锁分析上，全基因组关联分析研究在烟草上刚刚起步，烟草赤星病抗性位点关联分析还未见报道。本研究利用关联分析的方法，在不同环境条件下发掘与赤星病抗性相关的位点。在两个环境下对病情进行鉴定，共关联到38个标记位点，分布于14个连锁群；得到6个关联强度较大或被重复关联到的SSR标记PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727，分别位于6号、8号、9号、19号、3号和23号连锁群。与前人研究相比，本研究筛选到的标记数目更多，且定位的连锁群与已报道的研究結果存在部分重合。蒋彩虹等[17]利用连锁分析的方法筛选到一个与抗赤星病基因连锁的SSR标记J9，位于M号（即23号）连锁群。本研究利用关联分析的方法在23号连锁群J9附近定位到一个与抗性位点极显著关联的分子标记（PT50727），说明在烟草23号连锁群80cM附近存在一个控制赤星病抗性的稳定表达的主效QTL。
发掘控制赤星病抗性的主效位点，是进一步开展功能基因克隆和分子标记辅助选择的前提条件。本研究关联到了位于23号连锁群上的主效QTL，该优异等位基因存在于净叶黄和与净叶黄有明确系谱关系的单育二号、潘园黄等材料中，表明该主效QTL在烟草赤星病抗性中起到了重要作用。在本研究基础上，进一步开展该主效QTL的精细定位、克隆及分子标记位点开发，对于阐明烟草与赤星病菌间的互作机制和赤星病抗性分子标记辅助育种具有重要意义。 4 结论
利用404对具有多态性的SSR引物对96份自然群体种质材料进行群体结构分析和标记-表型性状的关联分析，标记位点PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727关联强度较大或被重复关联到，这些标记分别位于6号、8号、9号、19号、3号和23号连锁群。
参考文献
[1] 易龙，马冠华，王万能，等. 防治烟草赤星病有益内生细菌的筛选及抑菌作用[J]. 微生物学报，2004，44（1）：19-22.
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[17] 蒋彩虹，罗成刚，任民，等. 一个与净叶黄抗赤星病基因紧密连锁的SSR标记[J]. 中国烟草科学，2012，33（1）：19-22.
关键词：烟草；赤星病；SSR；关联分析
中图分类号：S435.72文章编号：1007-5119（2017）01-0068-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.012
Abstract：In order to screen for SSR markers associated with tobacco brown spot resistant genes and to provide useful information for breeders， 404 SSR markers were used to scan polymorphism among a population containing 96 tobacco germplasms in this study. Population structure was analyzed and association analysis between disease index and SSR markers were performed using TASSEL 2.1. 38 SSR markers were identified as being associated with resistant genes at the level of P≤0.01. The resultsalso indicated that PT60236， PT50668， PT50176， PT53770， PT60080 and PT50727 were tightly associated with resistant genes.These SSR markers were located in the 6th， 8th， 9th， 19th， 3th， 23th tobacco linkage group respectively. The markers identified in this study are useful in molecular marker assisted selection in tobacco breeding programs for brown spotresistance.
Keywords： tobacco；tobacco brown spot； SSR； association analysis
烟草是我国重要的经济作物，烟草赤星病是由链格孢菌[Alter aria alternata （Fries）Keissler]引起的烟叶成熟期病害，赤星病的发生可影响烟叶产量和品质，造成经济损失[1-3]。培育抗赤星病烟草品种是防治赤星病的重要有效方法。
Dobhal等[4]研究发现烟草对赤星病抗性为部分显性，受多基因控制。郭永峰等[5]研究表明烟草赤星病抗病基因的加性效应和显性效应同时存在，以加性效应为主。蒋彩虹等[6]研究发现一个与抗赤星病基因连锁的SSR标记连锁群，位于M号连锁群上，该连锁群包括12个SSR标记，全长181.5 cM，平均间距15.1 cM。Tong等[7]配制净叶黄和长脖黄杂交组合，利用SSR标记对F2群体进行抗性QTL分析，定位到3个连锁群，分别位于2号、3号和5号连锁群上。目前烟草抗赤星病QTL研究不多[8]，与赤星病抗性相关的标记数目较少且定位到的抗性连锁群不一致。Bindler等[9]发表一张烟草高密度遗传连锁图谱，其SSR引物覆盖烟草全基因组24个连锁群，可以充分发掘与赤星病抗性相關的标记。
目前有关烟草重要性状关联分析的报道主要集中在株高、叶数等基本农艺性状上[10]。烟草赤星病抗性的全基因组关联分析尚未见报道。本研究利用生产上常用的96份烤烟种质组成的自然群体和SSR分子标记，对烟草赤星病抗性进行标记-性状关联分析，筛选与抗性显著关联标记位点，为开展烟草赤星病抗性分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
中国烟草种质资源库提供供试群体材料，供试群体由表型变异丰富、遗传多样性较高的96份烤烟种质组成，包括35份国外引进种质和61份国内种质（表1）。
2015年2月，供试材料分别种植于诸城试验基地的自然病圃（T1环境）和即墨试验基地的自然病圃（T2环境）。随机区组设计，株距0.5 m，行距1.2 m，每个材料种植1行，每行10棵，重复2次。
1.2赤星病病情调查
烟苗移栽大田后60 d左右，调查供试材料的赤星病发病情况。根据叶片赤星病病斑的有无和大小，划分0级、1级、3级、5级、7级和9级。依据病级计算病情指数（the disease index，DI），DI =100×Σ（病级×该病级株数）/（总株数×最高病级）。
1.3 PCR扩增和电泳检测
在烟草旺长期，从同一品种株系中选取5株典型植株，混合取嫩叶，提取DNA。依据Bindler 2011年公布的烟草全基因组高密度遗传连锁图谱筛选出404对具有多态性的SSR引物，404对引物覆盖烟草全基因组24个连锁群，对供试群体DNA进行PCR扩增。扩增程序为95 ℃ 3 min；95 ℃30s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35次循环；72℃10 min。利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。参照任民等改进的银染方法进行显影[11]。 1.4数据统计分析
利用 Microsoft Excel 97—2003 统计供试群体赤星病病情指数（DI）；采用软件Structure 2.3.4[12]进行群体结构分析：K值设为1～7，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）开始时不作数迭代（length ofbum-in Period）设为100000，Number of MCMC Peps after burn-in设为100000，△K取最大值时，确定类群数目；应用软件Tassel 2.1的混合线性模型（MLM，Mixed Linear Model）[13]，代入群体结构的Q值、表型数据和SSR标记分型数据进行关联分析。
2结果
2.1供试群体病情指数分析
两种环境下供试群体的病情指数见图1。T1环境中，供试材料的病情指数相对集中，主要分布在50～75；T2环境中，供试材料的病情指数主要分布在50～62.5。两种环境下群体病情指数的相关性r=0.60，说明两个群体的病情指数存在中度相关。对供试群体的病情指数统计分析显示，T1环境下偏度系数Skewness=0.144，峰度系数Kurtosis=-0.327，两个系数均小于1，可认为其频率符合正态分布；T2环境下，偏度系数Skewness=-0.544，峰度系数Kurtosis=-0.161，两个系数均小于1，其频率同样符合正态分布。
分析供试群体的病情指数可以发现NC82、C151、革新5号等14份种质材料在两个环境下都表现为高度感病；T1环境下，单育二号表现为高度抗病，净叶黄、潘圆黄等21份种质表现为抗病；T2环境下，单育二号、净叶黄、潘圆黄等13份种质
表现为高度抗病，RG17、9201等11份种质表现为抗病；两个试验点均未发现对赤星病免疫的种质材料。
2.2 供试群体遗传结构分析
供试群体的遗传结构分析结果见图2，当K=3时，△K取得最大值，即表明供试群体可分为3个亚群，与供试群体的系谱来源基本一致。
2.3SSR标记-表型性状关联分析
404对具有多态性的SSR标记和群体病情指数的关联分析结果见表2。在显著水平（P≤0.01）下，T1环境中共关联到29个标记位点，分布在13个连锁群上；T2环境中关联到13个标记位点，分布在9个连锁群上。其中PT60236、PT50668、PT50176、PT53770在T1和T2环境下均被关联到。
在极显著水平（P≤0.001）下，T1环境中关联到10个标记位点，分布在3号、5号、8号、16号、17号、19号、23号、24号连锁群上；T2环境中关联到3个标记位点，分布在9号、17号、19号连锁群上。其中PT53770位点在两个环境下都被关联到，位于19号连锁群上。
综合两种环境下的关联结果：PT60236、PT50668、PT50176、PT53770被重复关联到，分别位于6号、8号、9号和19号连锁群（图3）上；PT60080和PT50727只在T1环境下被关联到，两个标记的P值分别为1.6923×10-5和1.6945×10-5，关联强度较大，分别位于3号和23号连锁群（图3）。这些被重复关联到或关联强度较大的位点，可用于烟草赤星病抗性标记辅助选择育种。
3讨论
烟草赤星病是烟叶生产的主要真菌性病害，对烟叶生产造成严重危害，培育抗性品种是最有效的措施之一。在本研究比较了96份生产上常用的烤烟品种（系）在不同环境条件下的赤星病抗性表现，得到以下几个结论：第一，不同烤烟品种间赤星病抗性存在很大的遗传变异，病情指数从1.23到100，平均61.47，两个环境下的病情指数均符合正态分布，表明烟草对赤星病抗性属于数量性状，受多基因控制，易受环境影响。第二，在连续两个环境条件下，净叶黄、单育二号、潘园黄等材料的赤星病抗性都鉴定为抗病，而这几个材料都具有明显的系谱关系，这说明在烟草种质中存在控制赤星病抗性的主效QTL。定位赤星病抗性基因所在染色体位置，发掘与之紧密连锁的分子标记，对开展烟草赤星病抗性改良工作具有可行性和重要性。
目前数量性状定位研究主要采用的方法为连锁分析方法和关联分析方法。连锁分析以亲本杂交后代的分离群体为研究对象，所以研究局限于两个亲本的遗传背景，且配制分离群体的过程中需要多次的自交和杂交，研究周期较长。而关联分析方法可利用自然群体，具有节约群体构建所需时间和检测相同位点上的多个不同等位基因变异等优势，已在各种主要作物上广泛应用[14-16]。由于普通烟草属于异源四倍体，基因组约4.5Gb，可用的分子标记较少。烟草重要性状定位研究主要集中在连锁分析上，全基因组关联分析研究在烟草上刚刚起步，烟草赤星病抗性位点关联分析还未见报道。本研究利用关联分析的方法，在不同环境条件下发掘与赤星病抗性相关的位点。在两个环境下对病情进行鉴定，共关联到38个标记位点，分布于14个连锁群；得到6个关联强度较大或被重复关联到的SSR标记PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727，分别位于6号、8号、9号、19号、3号和23号连锁群。与前人研究相比，本研究筛选到的标记数目更多，且定位的连锁群与已报道的研究結果存在部分重合。蒋彩虹等[17]利用连锁分析的方法筛选到一个与抗赤星病基因连锁的SSR标记J9，位于M号（即23号）连锁群。本研究利用关联分析的方法在23号连锁群J9附近定位到一个与抗性位点极显著关联的分子标记（PT50727），说明在烟草23号连锁群80cM附近存在一个控制赤星病抗性的稳定表达的主效QTL。
发掘控制赤星病抗性的主效位点，是进一步开展功能基因克隆和分子标记辅助选择的前提条件。本研究关联到了位于23号连锁群上的主效QTL，该优异等位基因存在于净叶黄和与净叶黄有明确系谱关系的单育二号、潘园黄等材料中，表明该主效QTL在烟草赤星病抗性中起到了重要作用。在本研究基础上，进一步开展该主效QTL的精细定位、克隆及分子标记位点开发，对于阐明烟草与赤星病菌间的互作机制和赤星病抗性分子标记辅助育种具有重要意义。 4 结论
利用404对具有多态性的SSR引物对96份自然群体种质材料进行群体结构分析和标记-表型性状的关联分析，标记位点PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727关联强度较大或被重复关联到，这些标记分别位于6号、8号、9号、19号、3号和23号连锁群。
参考文献
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