【摘 要】
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目的 构建pLVX-CD63-mNeptune-Puro重组质粒,使用HEK293T细胞包装慢病毒,探讨慢病毒经超滤浓缩后的纯化效果极其对MGC-803细胞的转染效应.方法 使用重叠PCR方法构建CD63-mNep
【机 构】
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河南中医药大学,河南郑州450046;河南中医药大学第一附属医院检验科,河南郑州450000
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目的 构建pLVX-CD63-mNeptune-Puro重组质粒,使用HEK293T细胞包装慢病毒,探讨慢病毒经超滤浓缩后的纯化效果极其对MGC-803细胞的转染效应.方法 使用重叠PCR方法构建CD63-mNeptune融合基因,并插入pLVX-Puro载体构建转移质粒.转移质粒、包装质粒和外膜蛋白质粒共转染HEK293T细胞包装慢病毒颗粒.收集转染后48 h及72h细胞培养液,4℃下2 500 ×g离心10 min去除细胞沉淀和碎片,上清液通过0.45 μm PVDF Millex-HV滤器过滤,收集滤液于15 mL离心管.取1 mL滤液于1.5 mL EP管,余下滤液用截留分子量100 000超滤管进行浓缩.使用P24检测试剂盒检测浓缩前后细胞培养液中病毒颗粒数.分别使用未浓缩慢病毒液与超滤浓缩慢病毒液感染MGC-803细胞.通过观察MGC-803细胞荧光信号来比较慢病毒的感染率.结果 成功构建慢病毒转移质粒并使用HEK293T细胞包装出慢病毒颗粒,细胞上清液中的慢病毒颗粒数经超滤浓缩后浓度提高了264倍,使用超滤浓缩的慢病毒液感染细胞后,荧光显微镜观察到携带荧光信号的活细胞多于未浓缩慢病毒液.结论 超滤浓缩可以提高慢病毒颗粒浓度,并提高细胞感染率.采用超滤浓缩慢病毒的方法适合大多数普通实验室操作.
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