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摘要：【目的】分离、鉴定土沉香幼苗炭疽病病原，为有效防治土沉香炭疽病提供病原学基础。【方法】从土沉香苗圃采集炭疽病样本，采用常规组织分离法分离病原菌，以伤口接种法接种病原菌进行致病性测定，并以形态学结合病原菌核糖体转录间隔区（ITS）、β-微管蛋白（TUB2）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GPDH）分子系统学分析，对分离菌株进行鉴定。【结果】分离获得的AC01菌株在PDA培养基上25℃暗培养7d后，其菌落呈圆形，初为白色或灰白色，后期渐变成灰黑色，分生孢子无色，单细胞，圆柱状，光滑，两端钝圆或一端稍尖，平均大小为（17.09±1.11）μmx（5.26±0.55）μm，分生孢子附着胞浅褐色，近椭圆形，边缘光滑完整，平均大小为（6.72±0.77）μmx（5.45±0.68）μm；病原菌ITS、TUB2和GPDH 3个基因联合系统发育进化树显示，AC01菌株与核果炭疽菌（Colletotrichum fructicola）模式菌株聚在同一进化分支上。【结论】根据形态特征结合基因系统发育进化树分析，确定AC01菌株为核果炭疽菌（C.fructicola），是国内首次在土沉香上发现该菌引起炭疽病。
关键词：土沉香；炭疽病；病原菌鉴定；核果炭疽菌
0引言
【研究意义】土沉香又名白木香，为国家二级濒危保护植物，其产品沉香是一种传统的名贵药材和天然香料，经济价值非常高，其产品供不应求（陈树思和唐为萍，2003；陈旭玉等，2017）。由于不合理采收，导致野生土沉香林遭受严重破坏，目前仅存少量零星植株（朱积余和廖培来，2006），产量远不能满足市场需求。近年来，广西土沉香人工林发展迅速，种植面积逐渐扩大，随之而来的土沉香病害也逐渐增多。2015～2016年本课题组对广西林业科学研究院土沉香苗圃进行调查时发现，土沉香苗部分叶片感染炭疽病，病斑坏死面积较大，引起落叶，影响植株正常生长，若使用带病植株造林，势必会影响植株后续健康生长。因此，明确土沉香幼苗炭疽病病原，了解该病发生流行规律，对制定精准防治措施具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于土沉香苗木的研究主要集中在快繁培育（何旭君等，2006；黎明等，2006；徐强兴等，2006）和生长节律（梁国校等，2011）方面，而针对苗木培育过程中可能出现有害生物危害的研究报道较少。李增平和陈坚（2008）研究发现了白木香幼苗的新病害——立枯病，经鉴定其病原菌为立枯丝核菌张争等（2013）首次明确白木香枝枯病病原菌为可可毛色二孢李涛等（2015）明确了云南河口土沉香炭疽病发生规律及环境影响因素，对科学防治土沉香炭疽病具有重要的指导作用，但未对其病原菌进行鉴定；苏圣淞等（2017）首次发现象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii Yang&Eisenback）可引起土沉香根结线虫病。【本研究切入点】优良无病苗木是营造健康人工林的关键因素之一，但目前有关土沉香苗期炭疽病病原的研究报道甚少。【拟解决的关键问题】采用组织分离法从感染炭疽病的土沉香叶片中分离病原菌菌株，采用病原菌形态学结合分子生物学的方法对分离获得的病原菌菌株进行鉴定，为有效防治土沉香炭疽病提供病原学基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试样品：2015～2016年从广西林业科学研究院森林经营研究所土沉香苗圃采集有褐色圆形或不规则形或轮纹状病斑的叶片。培养基：分离、纯化和鉴定培养基（PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000 mL），菌株保存斜面培养基（PCA培养基：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼脂20g、水1000mL）。
1.2病原菌分离与培养
参考方中达（2001）的方法，采用常规组织分离法分离病原菌，分离获得的病原菌菌株经单孢纯化后挑取菌丝保存至PCA斜面培养基上，25℃暗培养10-15d，将斜面培养物置于4℃冰箱中保存备用。选取AC01菌株为供试菌株。
1.3致病性测定
供试菌株在PDA培养基上25℃培养5d备用。采用伤口接种法接种病原菌，接种材料为健康的土沉香苗成熟叶。用解剖针在健康土沉香苗成熟叶近叶尖处刺6个针眼，用解剖刀挑取1.0 cmx0.5cm菌块正面贴于伤口处，无菌脱脂棉沾1.0%葡萄糖水后覆盖菌块上，置于底部铺有湿润滤纸的30cmx15cm不锈钢托盘中，保鲜膜覆盖托盘，以接种无菌PDA为对照，处理及对照各接种10张叶片，常温下（25～30℃）保湿72h，然后去除脱脂棉。每日定期观察，记录发病情况，发病后对发病部位进行二次分离，根据柯赫氏法则，确定分离株与接种菌株是否一致（方中达，2001）。
1.4病原菌鉴定
将AC01菌株置于PDA培养基在25℃恒温、黑暗条件下培养，逐日观察。培养7d后，記录菌株培养性状，测量菌落直径，若产生分生孢子器，则观察、镜检、拍摄并测量病原分生孢子大小；若无，则继续培养，直至产生子实体。参考杨友联（2010）的方法进行分生孢子附着胞诱导，然后在显微镜下镜检、拍摄和测量其大小。
1.5病原菌分子系统学分析
1.5.1病原菌DNA提取病原菌的收集参考廖旺姣等（2015）的方法并略作修改。从25℃培养5d的菌落边缘挑取菌丝接种到装有100mL PDB（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL）培养液的三角瓶中，25℃、120 r/min暗培养，7 d后用4层灭菌纱布过滤，收集菌丝，置于80℃恒温烘箱中烘干至恒重；放人灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，参照天根生化（北京）科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒说明提供提取病原菌总DNA。
1.5.2基因序列测定及多基因系统分析参考朱英芝等（2015）的方法，选择真菌核糖体基因转录间隔区（ITS，ITS4/ITS5）、β-微管蛋白（TUB2，T1/β-tu-bulin2b）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GPDH，GDF1/GDR1）基因的引物扩增，PCR扩增反应体系和程序、测序结果处理与系统发育进化树构建均参考朱英芝等（2015）的方法。 2结果与分析
2.1发病症状
主要危害土沉香幼苗叶片。从叶尖或叶缘开始发病，叶片感病初期出现褐色小病点，后扩展成圆形、三角形或不规则形褐色大斑，少数病斑可形成不明显轮纹，后期病斑中部变为灰白色，可见轮状小黑点，即病原菌分生孢子器（图1-A）。病害发生严重时引起叶片发黄，提前脱落，造成树势衰弱。
2.2病原菌分离与致病性测定结果
从土沉香炭疽病样品中共分离获得20株菌株，各菌株菌落特征一致。依据柯赫氏法则，对分离株进行致病性测定，接种3 d后接种部位开始呈褐色，随后病斑逐渐扩大呈圆形或不规则形，后期病斑上产生黑色分生孢子器，湿度较大时溢出橘红色分生孢子堆，发病症状与自然感病症状相似（图1-B）；对接种部位进行二次分离，结果显示，二次分离菌株与接种菌株培养性状一致，形态特征相同，因此可确定AC01菌株为土沉香炭疽病致病菌。
2.3病原菌菌落及形态特征
在PDA培养基上，AC01菌株的菌落平均生长速率为10.78 mm/d。菌落圆形，呈灰色至灰黑色，边缘色稍浅，中间色深，气生菌丝发达，绒毛状，边缘整齐，背面产生黑色色素（图1-c和图1-D）。培养后期产生黑色分生孢子器，其上可见橘红色黏液，分生孢子无色，单细胞，圆柱状，光滑，两端钝圆或一端稍尖，具有1～2个油球，平均大小为（17.09+1.11）μmx（5.26±0.55）岬（图1-E）。分生孢子附着胞浅褐色，呈圆形或近椭圆形，边缘完整，平均大小为（6.72±0.77）μmx（5.45±0.68）μm（图1-F），形态特征与杨友联等（2014）报道的核果炭疽菌（Colletotrichum fruc-ticola）相符。
2.4病原菌多基因序列分析结果
获得AC01菌株的ITS、TUB2和GPDH基因序列后，用ClustalX 2.0对测得的序列及GenBank中下载的各基因序列分别进行比对，手工校正后各基因首尾相連，构建上述3个基因联合系统发育进化树。结果显示，AC01菌株与包括C fructicola模式菌株C1315.3在内的菌株聚在同一分支上，遗传进化距离最近，与其他炭疽菌形成不同分支，具有较大的遗传差异，各分支间均有99%或100%的支持率，遗传关系清晰（图2）。因此，确定AC01菌株为C fructicola。
3讨论
C.fructicola可引起多种作物发生炭疽病，国外报道有小粒咖啡、深波叶补血草、沙梨、草莓和葡萄等植物；国内在棉花、茶树和油茶等作物上亦有该菌的报道（李河等，2014；刘威等，2014；杨友联等，2014）。本研究结果表明，土沉香幼苗炭疽病的病原菌为C.fructicola，土沉香是e fruc-ticola的新记录寄主。
不同寄主植物获得的C.fructicola培养性状相似或略有差异。李河等（2014）、杨友联等（2014）报道的C.fructicola菌落形态相似：菌落呈浅灰色至深灰色，边缘色浅，背面微黄色，有黑色素沉积；本研究获得的C.fructicola与其略有差异：菌落呈灰色至灰黑色，边缘色稍浅，中间色深，背面亦有黑色素沉积，但没有微黄色，可能与菌株来源不同有关。
本研究获得的C.fructicola其分生孢子形态与杨友联等（2014）报道的胶孢炭疽菌（C.gloeospori-oides）（CCOW3）非常相似。C.fructicola分子孢子呈圆柱状，两端钝圆或一端稍尖，C.gloeosporioides分生孢子也呈圆柱状，两端钝圆，部分孢子基部宽于顶部，从形态上很难将两者区分。杨友联等（2011）报道使用多基因分子系统学分析法能有效解决形态分类未解决的疑问，提高炭疽菌的识别准确率。因此，本研究采用ITS、TUB2和GPDH 3个基因联合分析，结果表明，土沉香炭疽病菌AC01菌株与不同来源的C.fructicola聚在同一分支上，而与C.gloeospo-rioides（CCOW3）形成明显的进化分支，有效地区分了这两种炭疽菌，说明使用多基因分子系统学分析法鉴别炭疽病菌种类具有可行性。
4结论
通过对病原菌的形态特征进行观察并结合多基因分子系统分析，确定土沉香幼苗炭疽病病原菌为核果炭疽菌（C.fructicola），是国内首次在土沉香上发现该菌引起的炭疽病。增补了C.fructicola的寄主范围，在防治其他由C.fructicola引起炭疽病的寄主植物时，要充分了解C.fructicola的寄主范围，统筹防治，才能取得良好的防治效果。
关键词：土沉香；炭疽病；病原菌鉴定；核果炭疽菌
0引言
【研究意义】土沉香又名白木香，为国家二级濒危保护植物，其产品沉香是一种传统的名贵药材和天然香料，经济价值非常高，其产品供不应求（陈树思和唐为萍，2003；陈旭玉等，2017）。由于不合理采收，导致野生土沉香林遭受严重破坏，目前仅存少量零星植株（朱积余和廖培来，2006），产量远不能满足市场需求。近年来，广西土沉香人工林发展迅速，种植面积逐渐扩大，随之而来的土沉香病害也逐渐增多。2015～2016年本课题组对广西林业科学研究院土沉香苗圃进行调查时发现，土沉香苗部分叶片感染炭疽病，病斑坏死面积较大，引起落叶，影响植株正常生长，若使用带病植株造林，势必会影响植株后续健康生长。因此，明确土沉香幼苗炭疽病病原，了解该病发生流行规律，对制定精准防治措施具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于土沉香苗木的研究主要集中在快繁培育（何旭君等，2006；黎明等，2006；徐强兴等，2006）和生长节律（梁国校等，2011）方面，而针对苗木培育过程中可能出现有害生物危害的研究报道较少。李增平和陈坚（2008）研究发现了白木香幼苗的新病害——立枯病，经鉴定其病原菌为立枯丝核菌张争等（2013）首次明确白木香枝枯病病原菌为可可毛色二孢李涛等（2015）明确了云南河口土沉香炭疽病发生规律及环境影响因素，对科学防治土沉香炭疽病具有重要的指导作用，但未对其病原菌进行鉴定；苏圣淞等（2017）首次发现象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii Yang&Eisenback）可引起土沉香根结线虫病。【本研究切入点】优良无病苗木是营造健康人工林的关键因素之一，但目前有关土沉香苗期炭疽病病原的研究报道甚少。【拟解决的关键问题】采用组织分离法从感染炭疽病的土沉香叶片中分离病原菌菌株，采用病原菌形态学结合分子生物学的方法对分离获得的病原菌菌株进行鉴定，为有效防治土沉香炭疽病提供病原学基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试样品：2015～2016年从广西林业科学研究院森林经营研究所土沉香苗圃采集有褐色圆形或不规则形或轮纹状病斑的叶片。培养基：分离、纯化和鉴定培养基（PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000 mL），菌株保存斜面培养基（PCA培养基：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼脂20g、水1000mL）。
1.2病原菌分离与培养
参考方中达（2001）的方法，采用常规组织分离法分离病原菌，分离获得的病原菌菌株经单孢纯化后挑取菌丝保存至PCA斜面培养基上，25℃暗培养10-15d，将斜面培养物置于4℃冰箱中保存备用。选取AC01菌株为供试菌株。
1.3致病性测定
供试菌株在PDA培养基上25℃培养5d备用。采用伤口接种法接种病原菌，接种材料为健康的土沉香苗成熟叶。用解剖针在健康土沉香苗成熟叶近叶尖处刺6个针眼，用解剖刀挑取1.0 cmx0.5cm菌块正面贴于伤口处，无菌脱脂棉沾1.0%葡萄糖水后覆盖菌块上，置于底部铺有湿润滤纸的30cmx15cm不锈钢托盘中，保鲜膜覆盖托盘，以接种无菌PDA为对照，处理及对照各接种10张叶片，常温下（25～30℃）保湿72h，然后去除脱脂棉。每日定期观察，记录发病情况，发病后对发病部位进行二次分离，根据柯赫氏法则，确定分离株与接种菌株是否一致（方中达，2001）。
1.4病原菌鉴定
将AC01菌株置于PDA培养基在25℃恒温、黑暗条件下培养，逐日观察。培养7d后，記录菌株培养性状，测量菌落直径，若产生分生孢子器，则观察、镜检、拍摄并测量病原分生孢子大小；若无，则继续培养，直至产生子实体。参考杨友联（2010）的方法进行分生孢子附着胞诱导，然后在显微镜下镜检、拍摄和测量其大小。
1.5病原菌分子系统学分析
1.5.1病原菌DNA提取病原菌的收集参考廖旺姣等（2015）的方法并略作修改。从25℃培养5d的菌落边缘挑取菌丝接种到装有100mL PDB（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL）培养液的三角瓶中，25℃、120 r/min暗培养，7 d后用4层灭菌纱布过滤，收集菌丝，置于80℃恒温烘箱中烘干至恒重；放人灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，参照天根生化（北京）科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒说明提供提取病原菌总DNA。
1.5.2基因序列测定及多基因系统分析参考朱英芝等（2015）的方法，选择真菌核糖体基因转录间隔区（ITS，ITS4/ITS5）、β-微管蛋白（TUB2，T1/β-tu-bulin2b）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GPDH，GDF1/GDR1）基因的引物扩增，PCR扩增反应体系和程序、测序结果处理与系统发育进化树构建均参考朱英芝等（2015）的方法。 2结果与分析
2.1发病症状
主要危害土沉香幼苗叶片。从叶尖或叶缘开始发病，叶片感病初期出现褐色小病点，后扩展成圆形、三角形或不规则形褐色大斑，少数病斑可形成不明显轮纹，后期病斑中部变为灰白色，可见轮状小黑点，即病原菌分生孢子器（图1-A）。病害发生严重时引起叶片发黄，提前脱落，造成树势衰弱。
2.2病原菌分离与致病性测定结果
从土沉香炭疽病样品中共分离获得20株菌株，各菌株菌落特征一致。依据柯赫氏法则，对分离株进行致病性测定，接种3 d后接种部位开始呈褐色，随后病斑逐渐扩大呈圆形或不规则形，后期病斑上产生黑色分生孢子器，湿度较大时溢出橘红色分生孢子堆，发病症状与自然感病症状相似（图1-B）；对接种部位进行二次分离，结果显示，二次分离菌株与接种菌株培养性状一致，形态特征相同，因此可确定AC01菌株为土沉香炭疽病致病菌。
2.3病原菌菌落及形态特征
在PDA培养基上，AC01菌株的菌落平均生长速率为10.78 mm/d。菌落圆形，呈灰色至灰黑色，边缘色稍浅，中间色深，气生菌丝发达，绒毛状，边缘整齐，背面产生黑色色素（图1-c和图1-D）。培养后期产生黑色分生孢子器，其上可见橘红色黏液，分生孢子无色，单细胞，圆柱状，光滑，两端钝圆或一端稍尖，具有1～2个油球，平均大小为（17.09+1.11）μmx（5.26±0.55）岬（图1-E）。分生孢子附着胞浅褐色，呈圆形或近椭圆形，边缘完整，平均大小为（6.72±0.77）μmx（5.45±0.68）μm（图1-F），形态特征与杨友联等（2014）报道的核果炭疽菌（Colletotrichum fruc-ticola）相符。
2.4病原菌多基因序列分析结果
获得AC01菌株的ITS、TUB2和GPDH基因序列后，用ClustalX 2.0对测得的序列及GenBank中下载的各基因序列分别进行比对，手工校正后各基因首尾相連，构建上述3个基因联合系统发育进化树。结果显示，AC01菌株与包括C fructicola模式菌株C1315.3在内的菌株聚在同一分支上，遗传进化距离最近，与其他炭疽菌形成不同分支，具有较大的遗传差异，各分支间均有99%或100%的支持率，遗传关系清晰（图2）。因此，确定AC01菌株为C fructicola。
3讨论
C.fructicola可引起多种作物发生炭疽病，国外报道有小粒咖啡、深波叶补血草、沙梨、草莓和葡萄等植物；国内在棉花、茶树和油茶等作物上亦有该菌的报道（李河等，2014；刘威等，2014；杨友联等，2014）。本研究结果表明，土沉香幼苗炭疽病的病原菌为C.fructicola，土沉香是e fruc-ticola的新记录寄主。
不同寄主植物获得的C.fructicola培养性状相似或略有差异。李河等（2014）、杨友联等（2014）报道的C.fructicola菌落形态相似：菌落呈浅灰色至深灰色，边缘色浅，背面微黄色，有黑色素沉积；本研究获得的C.fructicola与其略有差异：菌落呈灰色至灰黑色，边缘色稍浅，中间色深，背面亦有黑色素沉积，但没有微黄色，可能与菌株来源不同有关。
本研究获得的C.fructicola其分生孢子形态与杨友联等（2014）报道的胶孢炭疽菌（C.gloeospori-oides）（CCOW3）非常相似。C.fructicola分子孢子呈圆柱状，两端钝圆或一端稍尖，C.gloeosporioides分生孢子也呈圆柱状，两端钝圆，部分孢子基部宽于顶部，从形态上很难将两者区分。杨友联等（2011）报道使用多基因分子系统学分析法能有效解决形态分类未解决的疑问，提高炭疽菌的识别准确率。因此，本研究采用ITS、TUB2和GPDH 3个基因联合分析，结果表明，土沉香炭疽病菌AC01菌株与不同来源的C.fructicola聚在同一分支上，而与C.gloeospo-rioides（CCOW3）形成明显的进化分支，有效地区分了这两种炭疽菌，说明使用多基因分子系统学分析法鉴别炭疽病菌种类具有可行性。
4结论
通过对病原菌的形态特征进行观察并结合多基因分子系统分析，确定土沉香幼苗炭疽病病原菌为核果炭疽菌（C.fructicola），是国内首次在土沉香上发现该菌引起的炭疽病。增补了C.fructicola的寄主范围，在防治其他由C.fructicola引起炭疽病的寄主植物时，要充分了解C.fructicola的寄主范围，统筹防治，才能取得良好的防治效果。