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【摘要】 目的 了解白细胞介素31（IL31）基因单核苷酸多态性（SNP）各等位基因和基因型在广西地区人群中的分布频率，同时比较其在不同种族人群之间分布的差异。
方法 采用单碱基延伸的PCR技术（PCRSBE），对来自广西各地区的197例健康人群的IL31基因rs10847385A/C多态性进行了检测，并将结果同人类基因组计划公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人等四个种族人群的SNP分型数据进行比较，分析不同种族人群的等位基因和基因型分布频率的差异。
结果 在中国广西地区人群中存在着IL31基因rs10847385A/C多态性。其等位基因和基因型分布频率在男女组间比较差异均无统计学意义（P>005），但该多态性位点等位基因和基因型的分布频率与非洲和日本人群比较，差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲和中国北京人群相比，差异均无统计学意义（P>005）。
结论 在中国广西人群中存在IL31基因多态性，且与性别不存在相关性，但与其他种族人群比较存在显著差异，这种差异可能导致一些疾病在不同种族间的发病率和临床表现存在显著不同。
【关键词】 IL31基因；单核苷酸多态性；种族
中图分类号：R446.11 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.06.001
白细胞介素31（IL31）属于IL6细胞因子家族成员，主要由活化的Th2细胞产生，在活化的CD4+T细胞中有较高的表达，激活的CD8+T细胞仅有低水平表达，其通过介导其他细胞因子和炎症介质的表达，刺激成纤维细胞增殖，发挥促脏器炎症的作用，此外还具有调节细胞增殖分化、促进造血等多种生物学功能[1～3]。分子遗传学研究表明，IL31基因定位于12q24.31全长904 bp，开放阅读框495 bp，编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链。IL31存在着单核苷酸多态性且有关IL31基因多态性与非过敏性湿疹等多种疾病的研究国外已有文献报道[4]，但尚未见其在广西人群中的研究，而广西是壮族、汉族、瑶族、苗族、侗族等多个民族的聚居之地，研究IL31基因多态性在广西人群中的分布规律具有非常重要的意义。笔者采用单碱基延伸的PCR技术（PCRSBE）对来自广西地区的197例健康人群中IL31基因单核苷酸多态性（SNP）进行了研究，并将结果同人类基因组计划（Hapmap）公布的4个种族人群（欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人）的SNP分型数据进行比较，以探讨在不同种族健康人群中基因多态性的分布差异，从而为人类学和群体遗传学等的研究奠定基础。
1 对象与方法
1.1 研究对象
随机选取在我院体检健康并且来自广西地区，相互间无血缘关系的个体197例，其中男116例，女81例；年龄25～84岁。所有对象的各项临床和实验室检查数据均在正常范围内。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
用EDTAK2抗凝管采集以上对象的静脉血2 ml，白细胞基因组DNA的提取方法，参照已建立的改良碘化钠法[5]。
1.2.2 引物设计与合成
根据IL31基因rs
10847385A/C位点多态性和已知的DNA序列用在线Primer3 软件（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）设计PCR引物，引物合成由上海天昊生物科技有限公司来完成。用于rs10847385A/C位点的上游引物序列为：5′ATCGTGCCTCTGCAATCTCAGG3′；下游引物序列为：5′AATTGCTTGA GCCCAGGAGACA3′；延伸引物序列为：5′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAAGGATTTCAAGCAAT AACTCTGGA3′。
1.2.3 PCR扩增
IL31的PCR扩增反应体系共为20 μL，其中包含了10×PCR缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，模板DNA1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积均用灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR产物采用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR来获得，PCR产物通过虾碱酶（SAP，from Promega）和外切酶I（EXO I，from Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit来进行延伸反应。延伸的产物用虾碱酶（SAP，from Promega）纯化后在ABI3730XL上样。用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）来分析SNP分型。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5软件包进行统计分析。各等位基因和基因型分布频率均采用直接计数法计算，各组间等位基因和基因型分布的频率比较采用χ2检验，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IL31基因型检测结果
IL31基因rs108
47385A/C多态性，经PCR扩增后的产物片段大小分别为180bp。SNP分型结果显示rs10847385A/C位点存在着AA、AC和CC三种基因型。基因测序再一次验证了我们的检测结果，见图1A、B、C。
图1 IL31基因rs10847385A/C测序图注：A、B、C分别为AA、AC、CC基因型；箭头所指为基因突变位点。
2.2 IL31基因多态性在广西健康人群中的分布
经χ2检验分析，结果显示IL31基因rs10847385A/C位点的等位基因和基因型分布频率均符合HardyWein berg遗传平衡，说明我们所选取的研究对象具有一定的群体代表性。其中rs10847385A/C位点以AA基因型出现频率最高占75.1%，其等位基因频率以A型最高占85.5%。其等位基因和基因型分布频率在男女之间比较差异均无统计学意义（P>005）。见表1。 2.3 IL31基因多态性在不同种族人群间的比较
将广西人IL31基因rs10847385A/C多态性分布频率同人类基因组计划（Hapmap）公布的四个种族人群的SNP分型数据进行比较，发现rs10847385A/C 多态性位点等位基因和基因型分布的频率与非洲人、日本人比较差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲人、北京人比较差异均无统计学意义（P>005）。见表2。
3 讨论
IL31属于短链细胞因子家族，为一具有4个螺旋结构的细胞因子，主要表达在活化的淋巴细胞，在肾、骨髓、胸腺、小肠等组织中也有少量表达[6]。生理状态下，IL31基因表达水平较低，但在炎症反应时表达水平较高，主要由激活的T细胞产生。IL31与其功能受体复合物结合后，可以不同程度地激活JAKSTAT、MAPK 和 Pi3K/Akt 三条通路进行信号转导，发挥诸如调节细胞增殖分化、促进造血、诱导炎性细胞因子和趋化因子分泌、参与和调节炎症反应等生物学功能[7～9]。IL31基因定位于12q24.31，全长904bp，含3个外显子，开放阅读框495bp，编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链，成熟的IL31蛋白分子含有141个氨基酸，在皮肤炎症发生中发挥着重要的作用。同时，IL31基因存在单核苷酸多态性，这种基因多态性可能影响到IL31基因的功能，进一步可能会对IL31基因多态性同某些相关疾病的发生和发展产生一定的影响，已有研究表明IL31基因多态性可能是哮喘[10]、瘙痒症和过敏性皮炎[11]、 过敏性湿疹[12]等疾病的危险因素。因此，分析 IL31基因多态性在不同种族健康人群中的分布规律，是更进一步研究IL31基因多态性与一些相关疾病的发生和发展的基础。
利用单碱基延伸PCR（PCRSBE）技术，我们对来自广西各地区人群的IL31基因rs10847385A/C多态性位点进行检测。结果显示，在所观察的人群中，广西人群rs10847385A/C多态性位点存在AA、AC和CC三种基因型，其频率分别为75.1%、20.8%和4.1%；等位基因A和C频率分别为85.5% 和145%。更进一步研究分析发现IL31基因rs10847385A/C多态性位点等位基因和基因型分布频率在男女之间比较，差异均无统计学意义（P>005），提示该位点多态性分布频率同性别没有相关性。将中国广西地区人群与欧洲、非洲、日本和中国北京等人群基因多态性研究结果比较分析发现，我国广西健康人群中IL31基因rs10847385A/C多态性位点等位基因和基因型分布的频率与非洲人、日本人比较差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲人、中国北京人比较差异均无统计学意义（P>005），提示IL31基因的等位基因和基因型分布频率在不同种族间存在明显差异，这可能与其所处地理环境、饮食习惯及生活方式等产生的影响有关。
总之，对中国广西人群IL31基因rs10847385
A/C位点多态性的研究分析，不仅为研究IL31多态性与相关疾病的发生和发展提供了重要的分子遗传学数据，而且为进一步从基因水平解释某些疾病的发病机制提供了基础性的资料。
参 考 文 献
[1] Gonzales AJ，Humphrey WR，Messamore JE，et al.Interleukin31：its role in canine pruritus and naturally occurring canineatopic dermatitis[J].Vet Dermatol，2013，24（1）：4853.e112.
[2] Niebuhr M，Mamerow D，Heratizadeh A，et al.Staphylococcal αtoxin induces a higher T cell proliferation and interleukin31 in atopic dermatitis[J].Int Arch Allergy Immunol，2011，156（4）：412415.
[3] Kasraie S，Niebuhr M，Baumert K，et al.Functional effects of interleukin 31 in human primary keratinocytes[J].Allergy，2011，66（7）：845852.
[4] Nagy N，Tanaka A，Techanukul T，et al.Common IL31 gene haplotype associated with nonatopic eczema is not implicated in epidermolysis bullosa pruriginosa[J].Acta Derm Venereol，2010，90（6）：631632.
[5] 蓝 艳，罗 斌，韦彩成，等.中国广西人群NogoB基因内含子区遗传多态性的检测[J].中国现代医学杂志，2012，22（22）：14.
[6] 郑 静，曹雪梅，孙万邦，等.IL31与特应性皮炎的相关性研究进展[J].北京医学，2009，31（5）：296298.
[7] Stott B，Lavender P，Lehmann S，et al.Human IL31 is induced by IL4 and promotes TH2driven inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2013，132（2）：446454.e5.
[8] Cornelissen C，LüscherFirzlaff J，Baron JM，et al.Signaling by IL31 and functional consequences[J].Eur J Cell Biol，2012，91（67）：552566.
[9] Zhang Q，Putheti P，Zhou Q，et al. Structures and biological functions of IL31 and IL31 receptors[J].Cytokine Growth Factor Rev，2008，19（56）：347356.
[10] Yu JI，Han WC，Yun KJ，et al.Identifying Polymorphisms in IL31 and Their Association with Susceptibility to Asthma[J].Korean J Pathol，2012，46（2）：162168.
[11] Sokot owskaWojdyto M，Gleń J，Zabtotna M，et al.Association of distinct IL31 polymorphisms with pruritus and severity of atopic dermatitis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2013，27（5）：662664.
[12] Lan CC，Tu HP，Wu CS，et al.Distinct SPINK5 and IL31 polymorphisms are associated with atopic eczema and nonatopic hand dermatitis in Taiwanese nursing population[J].Exp Dermatol，2011，20（12）：975979.
（编辑：梁明佩）
方法 采用单碱基延伸的PCR技术（PCRSBE），对来自广西各地区的197例健康人群的IL31基因rs10847385A/C多态性进行了检测，并将结果同人类基因组计划公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人等四个种族人群的SNP分型数据进行比较，分析不同种族人群的等位基因和基因型分布频率的差异。
结果 在中国广西地区人群中存在着IL31基因rs10847385A/C多态性。其等位基因和基因型分布频率在男女组间比较差异均无统计学意义（P>005），但该多态性位点等位基因和基因型的分布频率与非洲和日本人群比较，差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲和中国北京人群相比，差异均无统计学意义（P>005）。
结论 在中国广西人群中存在IL31基因多态性，且与性别不存在相关性，但与其他种族人群比较存在显著差异，这种差异可能导致一些疾病在不同种族间的发病率和临床表现存在显著不同。
【关键词】 IL31基因；单核苷酸多态性；种族
中图分类号：R446.11 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2014.06.001
白细胞介素31（IL31）属于IL6细胞因子家族成员，主要由活化的Th2细胞产生，在活化的CD4+T细胞中有较高的表达，激活的CD8+T细胞仅有低水平表达，其通过介导其他细胞因子和炎症介质的表达，刺激成纤维细胞增殖，发挥促脏器炎症的作用，此外还具有调节细胞增殖分化、促进造血等多种生物学功能[1～3]。分子遗传学研究表明，IL31基因定位于12q24.31全长904 bp，开放阅读框495 bp，编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链。IL31存在着单核苷酸多态性且有关IL31基因多态性与非过敏性湿疹等多种疾病的研究国外已有文献报道[4]，但尚未见其在广西人群中的研究，而广西是壮族、汉族、瑶族、苗族、侗族等多个民族的聚居之地，研究IL31基因多态性在广西人群中的分布规律具有非常重要的意义。笔者采用单碱基延伸的PCR技术（PCRSBE）对来自广西地区的197例健康人群中IL31基因单核苷酸多态性（SNP）进行了研究，并将结果同人类基因组计划（Hapmap）公布的4个种族人群（欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人）的SNP分型数据进行比较，以探讨在不同种族健康人群中基因多态性的分布差异，从而为人类学和群体遗传学等的研究奠定基础。
1 对象与方法
1.1 研究对象
随机选取在我院体检健康并且来自广西地区，相互间无血缘关系的个体197例，其中男116例，女81例；年龄25～84岁。所有对象的各项临床和实验室检查数据均在正常范围内。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
用EDTAK2抗凝管采集以上对象的静脉血2 ml，白细胞基因组DNA的提取方法，参照已建立的改良碘化钠法[5]。
1.2.2 引物设计与合成
根据IL31基因rs
10847385A/C位点多态性和已知的DNA序列用在线Primer3 软件（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）设计PCR引物，引物合成由上海天昊生物科技有限公司来完成。用于rs10847385A/C位点的上游引物序列为：5′ATCGTGCCTCTGCAATCTCAGG3′；下游引物序列为：5′AATTGCTTGA GCCCAGGAGACA3′；延伸引物序列为：5′TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAAGGATTTCAAGCAAT AACTCTGGA3′。
1.2.3 PCR扩增
IL31的PCR扩增反应体系共为20 μL，其中包含了10×PCR缓冲液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，模板DNA1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积均用灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR产物采用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR来获得，PCR产物通过虾碱酶（SAP，from Promega）和外切酶I（EXO I，from Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit来进行延伸反应。延伸的产物用虾碱酶（SAP，from Promega）纯化后在ABI3730XL上样。用GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）来分析SNP分型。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5软件包进行统计分析。各等位基因和基因型分布频率均采用直接计数法计算，各组间等位基因和基因型分布的频率比较采用χ2检验，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IL31基因型检测结果
IL31基因rs108
47385A/C多态性，经PCR扩增后的产物片段大小分别为180bp。SNP分型结果显示rs10847385A/C位点存在着AA、AC和CC三种基因型。基因测序再一次验证了我们的检测结果，见图1A、B、C。
图1 IL31基因rs10847385A/C测序图注：A、B、C分别为AA、AC、CC基因型；箭头所指为基因突变位点。
2.2 IL31基因多态性在广西健康人群中的分布
经χ2检验分析，结果显示IL31基因rs10847385A/C位点的等位基因和基因型分布频率均符合HardyWein berg遗传平衡，说明我们所选取的研究对象具有一定的群体代表性。其中rs10847385A/C位点以AA基因型出现频率最高占75.1%，其等位基因频率以A型最高占85.5%。其等位基因和基因型分布频率在男女之间比较差异均无统计学意义（P>005）。见表1。 2.3 IL31基因多态性在不同种族人群间的比较
将广西人IL31基因rs10847385A/C多态性分布频率同人类基因组计划（Hapmap）公布的四个种族人群的SNP分型数据进行比较，发现rs10847385A/C 多态性位点等位基因和基因型分布的频率与非洲人、日本人比较差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲人、北京人比较差异均无统计学意义（P>005）。见表2。
3 讨论
IL31属于短链细胞因子家族，为一具有4个螺旋结构的细胞因子，主要表达在活化的淋巴细胞，在肾、骨髓、胸腺、小肠等组织中也有少量表达[6]。生理状态下，IL31基因表达水平较低，但在炎症反应时表达水平较高，主要由激活的T细胞产生。IL31与其功能受体复合物结合后，可以不同程度地激活JAKSTAT、MAPK 和 Pi3K/Akt 三条通路进行信号转导，发挥诸如调节细胞增殖分化、促进造血、诱导炎性细胞因子和趋化因子分泌、参与和调节炎症反应等生物学功能[7～9]。IL31基因定位于12q24.31，全长904bp，含3个外显子，开放阅读框495bp，编码一条由164个氨基酸残基组成的多肽链，成熟的IL31蛋白分子含有141个氨基酸，在皮肤炎症发生中发挥着重要的作用。同时，IL31基因存在单核苷酸多态性，这种基因多态性可能影响到IL31基因的功能，进一步可能会对IL31基因多态性同某些相关疾病的发生和发展产生一定的影响，已有研究表明IL31基因多态性可能是哮喘[10]、瘙痒症和过敏性皮炎[11]、 过敏性湿疹[12]等疾病的危险因素。因此，分析 IL31基因多态性在不同种族健康人群中的分布规律，是更进一步研究IL31基因多态性与一些相关疾病的发生和发展的基础。
利用单碱基延伸PCR（PCRSBE）技术，我们对来自广西各地区人群的IL31基因rs10847385A/C多态性位点进行检测。结果显示，在所观察的人群中，广西人群rs10847385A/C多态性位点存在AA、AC和CC三种基因型，其频率分别为75.1%、20.8%和4.1%；等位基因A和C频率分别为85.5% 和145%。更进一步研究分析发现IL31基因rs10847385A/C多态性位点等位基因和基因型分布频率在男女之间比较，差异均无统计学意义（P>005），提示该位点多态性分布频率同性别没有相关性。将中国广西地区人群与欧洲、非洲、日本和中国北京等人群基因多态性研究结果比较分析发现，我国广西健康人群中IL31基因rs10847385A/C多态性位点等位基因和基因型分布的频率与非洲人、日本人比较差异均有统计学意义（P<005），而与欧洲人、中国北京人比较差异均无统计学意义（P>005），提示IL31基因的等位基因和基因型分布频率在不同种族间存在明显差异，这可能与其所处地理环境、饮食习惯及生活方式等产生的影响有关。
总之，对中国广西人群IL31基因rs10847385
A/C位点多态性的研究分析，不仅为研究IL31多态性与相关疾病的发生和发展提供了重要的分子遗传学数据，而且为进一步从基因水平解释某些疾病的发病机制提供了基础性的资料。
参 考 文 献
[1] Gonzales AJ，Humphrey WR，Messamore JE，et al.Interleukin31：its role in canine pruritus and naturally occurring canineatopic dermatitis[J].Vet Dermatol，2013，24（1）：4853.e112.
[2] Niebuhr M，Mamerow D，Heratizadeh A，et al.Staphylococcal αtoxin induces a higher T cell proliferation and interleukin31 in atopic dermatitis[J].Int Arch Allergy Immunol，2011，156（4）：412415.
[3] Kasraie S，Niebuhr M，Baumert K，et al.Functional effects of interleukin 31 in human primary keratinocytes[J].Allergy，2011，66（7）：845852.
[4] Nagy N，Tanaka A，Techanukul T，et al.Common IL31 gene haplotype associated with nonatopic eczema is not implicated in epidermolysis bullosa pruriginosa[J].Acta Derm Venereol，2010，90（6）：631632.
[5] 蓝 艳，罗 斌，韦彩成，等.中国广西人群NogoB基因内含子区遗传多态性的检测[J].中国现代医学杂志，2012，22（22）：14.
[6] 郑 静，曹雪梅，孙万邦，等.IL31与特应性皮炎的相关性研究进展[J].北京医学，2009，31（5）：296298.
[7] Stott B，Lavender P，Lehmann S，et al.Human IL31 is induced by IL4 and promotes TH2driven inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2013，132（2）：446454.e5.
[8] Cornelissen C，LüscherFirzlaff J，Baron JM，et al.Signaling by IL31 and functional consequences[J].Eur J Cell Biol，2012，91（67）：552566.
[9] Zhang Q，Putheti P，Zhou Q，et al. Structures and biological functions of IL31 and IL31 receptors[J].Cytokine Growth Factor Rev，2008，19（56）：347356.
[10] Yu JI，Han WC，Yun KJ，et al.Identifying Polymorphisms in IL31 and Their Association with Susceptibility to Asthma[J].Korean J Pathol，2012，46（2）：162168.
[11] Sokot owskaWojdyto M，Gleń J，Zabtotna M，et al.Association of distinct IL31 polymorphisms with pruritus and severity of atopic dermatitis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2013，27（5）：662664.
[12] Lan CC，Tu HP，Wu CS，et al.Distinct SPINK5 and IL31 polymorphisms are associated with atopic eczema and nonatopic hand dermatitis in Taiwanese nursing population[J].Exp Dermatol，2011，20（12）：975979.
（编辑：梁明佩）