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摘要[目的] 以白术为材料，研究白术内酯Ⅰ和III富集工艺条件。[方法]通过静态吸附和解吸比较6种大孔树脂对2种白术内酯的富集效果，对效果好的大孔树脂进行动态试验研究。[结果]用D101大孔树脂富集白术内酯Ⅰ和III的最佳工艺：上样液白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为25.6和59.7 μg/mL，上样量4 BV，流速2 BV/h，依次用16 BV水、6 BV 30%乙醇除杂，12 BV 75%乙醇以2 BV/h流速洗脱，白术内酯Ⅰ和III的回收率分别为100.00%和98.24%。[结论] D101大孔树脂富集白术粗提物中白术内酯Ⅰ和III的方法简单可行。
关键词 白术；白术内酯；富集；大孔树脂；工艺条件
中图分类号 R284.1；R282.71 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）24-131-05
Abstract[Objective] To research the enrichment process of atractylconolide Ⅰ and III with Atracttylodes macrocephala Koidz as the research materials.[Method] The enrichment effects of 6 different macroporous resins were compared by static adsorption and desorption experiments.Dynamic test was carried out on the best macroporous resin.[Result] The optimal technology of atractylconolide Ⅰ and III enrichment by D101 macroporous resin was as follows：mass concentrations of atractylcnolideⅠand III were 25.6.2 and 59.7 μg/mL，respectively； 4 BV sample volume，2 BV/h flow rate，eluting with 16 BV water，6 BV 30% ethanol and 12 BV 75% ethanol in turn.Under this condition，the the recovery rate of atractylcnolideⅠand III were up to 100.00% and 98.24%，respectively.[Conclusion] It is a simple and effective enrichment process of atractylcnolide from crude extracts of Atracttylodes macrocephala Koidz by D101 macroporous.
AbstractAtracttylodes macrocephala Koidz； Atractylenolide； Enrichment； Macroporous resin； Technology condition
白术为菊科（Compositae）植物白术（Atracttylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎，是我国传统中药之一，具有健脾、益气、安胎、止汗等功效，常用于脾虚食少、腹胀泄泻、胎动不安、自汗等症[1]。随着对白术研究的深入，证实其还具有降血糖、免疫调节、镇痛、抑制代谢活化酶、抗肿瘤等活性[2-4]。白术内酯Ⅰ和III是白术的有效成分，也是白术质量控制的主要指标[5-7]。但白术中白术内酯Ⅰ和III的含量较少，直接从白术提取的粗提物中白术内酯Ⅰ和III含量低[8-9]，不能满足医药行业的要求。因此，从白术粗提物中高效、快速地富集得到一定含量的白术内酯Ⅰ和III产品，具有很高的经济价值与现实意义。
大孔树脂具有吸附容量大、选择性高、可再生循环使用、工艺简单、不存在金属和有机溶剂毒性残留[10]等优点，已广泛应用于中药有效成分如黄酮、生物碱、多糖、皂苷等的富集纯化中[11-14]。从白术中提取白术内酯Ⅰ和III工艺研究已有不少报道[15-18]，但用大孔树脂富集纯化白术内酯Ⅰ和III的相关研究报道很少，仅李鸿翔等[19]尝试用AB-8 型大孔树脂分离纯化白术水提液中白术内酯III，且取得良好的效果。该研究以白术为材料，通过静态吸附和解吸比较6种大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的富集效果，对效果好的大孔树脂进行动态试验，研究2种白术内酯的富集工艺条件。
1 材料与方法
1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国惠普公司）；BSA124S型电子天平（北京慧龙环科环境仪器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QHZ-98B全温光照振荡培养箱（江苏省太仓市美华生化仪器厂）。
1.2 试材 白术内酯Ⅰ和III对照品（购自贵州省迪大科技有限责任公司，批号分别为GZ73069-12-3和GZ73030-71-4，纯度均大于99%）；白术购于贵阳药材市场，经贵阳中医学院席先蓉教授鉴定为白术（Atracttylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎。D101、NKA、X-5、H107、DM130、AB-8大孔树脂（湖南长沙大禹化工有限公司）。甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，乙醇为食用级，其余试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 白术内酯含量测定
1.3.1.1 对照品储备液的制备。分别精密称取白术内酯Ⅰ和III对照品2.0和4.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成白术内酯Ⅰ和III浓度分别为0.08和0.16 mg/mL的混合对照品储备液。 1.3.1.2 白术内酯粗提液的制备。称取适量白术药材粉末（过20目筛），加12倍体积分数85%乙醇，50 ℃超声提取2次，每次30 min，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，用体积分数为5%乙醇配成所需浓度，减压过滤，得黄色稍浑滤液，即白术粗提液。
1.3.1.3 色谱条件。ZORBAXSB.C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=65∶35；流速1.0 mL/min；检测波长220 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。在此条件下，色谱图见图1。
1.3.1.4 标准曲线的绘制。
分别精密吸取对照品储备液0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得白术内酯Ⅰ浓度分别为0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL和白术内酯III浓度分别为1.6、4.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL的对照品溶液。在“1.3.1.3”色谱条件下进行分析。以白术内酯质量浓度（μg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，求得白术内酯Ⅰ和III的回归方程分别为Y=38.822X+16.016（R2=0.999 9）、Y=27.333X+31.197（R2=0.999 9），表明白术内酯Ⅰ和III分别在0.8～80.0、1.6～160.0μg/mL范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系。
1.3.1.5 方法学考察。
（1）精密度试验。精密吸取对照品储备液10 μL，重复进样5次，白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为0.77%和0.55%，表明仪器精密度良好。
（2）稳定性试验。取白术内酯粗提液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h内测定，在8 h内白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为1.63%和1.68%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
（3）重复性试验。精密称取同一批次白术药材粉末5份，按“1.3.1.2”制备白术内酯粗提液，按“1.3.1.3”色谱条件测定其含量，测得白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为1.36%和1.40%，表明该方法重复性良好。
（4）加样回收率试验。精密称取已测知白术内酯Ⅰ和III含量的白术药材粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量的白术内酯Ⅰ和III对照品，按“1.3.1.2”制备白术内酯粗提液，按“1.3.1.3”色谱条件测定其含量，白术内酯Ⅰ的平均回收率为99%，RSD为1.63%，白术内酯III的平均回收率为98%，RSD为2.13%，表明该方法的回收率较好。
1.3.2 富集工艺优选。
1.3.2.1 大孔树脂的预处理。
新大孔树脂用95%的乙醇浸泡24 h，过滤，再用95%的乙醇冲洗至洗脱液与蒸馏水以1∶1混合清亮为止，然后用水洗至洗脱液无乙醇味，蒸干后无残余物，用水浸泡备用。
1.3.2.2 静态法筛选大孔树脂。
准确称取6种已处理好的大孔树脂各2.0 g （用注射器抽干水分后称重），置250 mL具塞锥形瓶中，各加入一定浓度的白术提取液100 mL，将具塞锥形瓶置于摇床，25 ℃恒温振荡24 h （80 r/min ），充分吸附后，过滤，测定滤液中白术内酯Ⅰ和III的含量。同时称取相同质量的各树脂，在105 ℃下干燥至恒重，测定各树脂的含水率，并计算其吸附量。按下列公式计算各种树脂静态吸附率：
式中，Q为吸附量（μg/g）；E为吸附率；C0为上样液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；C1为吸附平衡后滤液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；V为上样液体积（mL），M为树脂质量（g）。
将上述吸附饱和的6种大孔树脂用适量水洗涤，除去白术内酯提取液，然后加入50 mL水，于25 ℃恒温振荡120 min，过滤，并用注射器抽干水分。准确加入体积分数95%的乙醇溶液50 mL，25 ℃恒温振荡（ 80 r/min ）解吸24 h，过滤。精密移取滤液各10 mL，减压除尽溶剂，残余物用5%乙醇定容至10 mL，测定白术内酯Ⅰ和III的含量，按下列公式计算各种树脂静态解吸率：
式中，B为解吸率；C2为解吸液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；V1为解吸剂体积（mL）。
1.3.2.3 静态吸附动力学测定。
根据上述试验结果，筛选吸附和解吸效果好的2种大孔树脂进行动力学考察。精密称取大孔树脂2.0 g，放入250 mL具塞三角瓶中，加入白术内酯提取液100 mL（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为9.1和32.2 μg/mL），25 ℃恒温振荡（80 r/min ），在7 h内，每0.5 h取0.5 mL，取8份，然后每1 h取0.5 mL，测其白术内酯含量，绘制静态吸附动力学曲线，确定静态吸附平衡时间。
1.3.2.4 柱条件的优选。
（1）上样液浓度考察。称取D101大孔树脂4 份，湿法装成径高比为1∶6的树脂柱，取4种不同浓度白术内酯提取液各4 BV（白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为5.1和11.2、11.6和27.6、15.3和43.9、24.5和58.7 μg/mL，试验编号依次为1、2、3、4），以2 BV/h的流速分别通过4根树脂柱，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的吸附率，优选出最佳上样液浓度。
（2）上样流速考察。取4根径高比为1∶6的 D101大孔树脂柱，分别以1、2、3、4 BV/h的流速连续加入4 BV白术内酯提取液（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为16.3和43.1 μg/mL），待提取液全部通过树脂柱后，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的吸附率，优选出最佳上样流速。 （3）最大上样量考察。取1根径高比为1∶6的 D101大孔树脂柱，以1 BV/h的流速连续加入白术提取液（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为11.4和29.9 μg/mL），每份收集1 BV，测定白术内酯含量，以收集份数为横坐标、流出液中白术内酯质量浓度为纵坐标作图，根据泄漏情况得出最大上样量。
1.3.2.5 洗脱条件的优选。
（1）洗脱流速考察。取已知吸附量的4根树脂柱，先用适量去离子水（约16 BV）洗涤树脂至流出液为无色透明，再用4 BV体积分数为75%的乙醇为洗脱剂，分别以1、2、3、4 BV/h流速洗脱，待洗脱剂全部通过树脂后，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的洗脱率，优选出最佳洗脱流速。
（2）洗脱剂浓度考察。取已知吸附量的1根树脂柱，先用适量去离子水洗涤树脂至流出液为无色透明，再依次用2 BV体积分数30%、50%和75%乙醇，以2 BV/h流速洗脱，每份收集1 BV，测定白术内酯含量，计算白术内酯的洗脱率，优选出最佳洗脱剂浓度。
（3）洗脱剂用量考察。取已知吸附量、并用去离子水洗去提取液的树脂柱1根，用75%乙醇以2 BV/ h流速进行洗脱，每份收集1 BV，测定流出液白术内酯含量，以收集份数为横坐标、流出液中白术内酯质量浓度为纵坐标作图，得出洗脱剂用量。
1.3.2.6 大孔树脂重复使用次数的考察。①按优选出工艺参数进行上样和洗脱，考察大孔树脂重复使用次数。为了提高工作效率，洗脱流程稍作简化，即先用大量水冲洗掉大孔树脂柱中白术提取液，然后只用3 BV的30%乙醇除杂、8 BV的75%乙醇洗脱。②大孔树脂再生，用10 BV 95%乙醇树脂浸泡3次，每次1 h，再用10 BV 95%乙醇浸泡24 h，最后用水洗至无醇味。按①和②重复操作。
2 结果与分析
2.1 大孔树脂的筛选
2.1.1 大孔树脂静态吸附-解吸比较。影响大孔树脂吸附性能的因素有很多，通常大孔树脂的结构、极性、粒径、比表面积、孔径以及被吸附分子大小、结构、极性等是影响吸附性能的重要因素，不同型号的树脂，由于结构、极性等存在差异，导致对被吸附分子吸附、解吸的难易程度也不同。为寻找适合富集白术内酯的树脂，该试验选取D101、NKA、H107、X-5、DM130、AB-8大孔树脂对白术粗提液进行处理，运用静态吸附和解吸试验进行筛选。
由表1可知，6种大孔树脂对白术内酯吸附率和解吸率存在差异，说明大孔树脂对白术内酯的吸附、解吸有一定的选择性。综合考虑吸附和解吸情况，6种大孔树脂中D101、NKA和AB-8对白术内酯Ⅰ和III情况相当且效果最佳。李鸿翔等[19]已用AB-8对白术内酯III的分离纯化进行了研究，该试验选定D101和NKA大孔树脂进行进一步考察。
2.1.2 静态吸附动力学考察。
单用大孔树脂的静态吸附率和解吸率来评价其性能不是很全面，还应该考虑其吸附速度，所以需研究其静态吸附动力学特征。由图2可知，在0～0.5 h内，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的吸附较快，随后吸附速度减缓，白术内酯III在4 h时吸附基本达到平衡，白术内酯Ⅰ在4.5 h时吸附基本达到平衡。NKA大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的吸附情况与D101相似，但在5 h 时吸附才基本达到平衡，因此，确定用D101大孔树脂富集白术粗提物中的白术内酯。
2.2 D101树脂动态吸附试验
2.2.1 上样液浓度对吸附效果的影响。
大孔树脂吸附目标分子时存在一个吸附平衡，该平衡与上样液质量浓度有很大关系。试验中所选的4种质量浓度白术提取液，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ的吸附率均达100.00%，表明树脂吸附量尚未达到饱和状态；对白术内酯III的吸附率分别为100.00%、100.00%、92.48%和87.91%，表明在白术内酯III浓度较低的情况下，增加浓度（由11.2 μg/mL升至27.6 μg/mL），吸附率仍能达100.00%。这是因为浓度较低时，提高上柱液浓度可增加白术内酯分子与树脂的接触，加速白术内酯分子进入树脂内部并迅速扩散，随着浓度的提高树脂的吸附量也随之增加，吸附率保持不变。但若浓度再提高，如由27.6 μg/mL增加至43.9 μg/mL甚至58.7 μg/mL，吸附率随之而减少。因为随着浓度的再增大，被吸附的杂质量也随之加大，同时树脂接触表面白术内酯分子过多，阻碍其他白术内酯分子进入树脂内部，影响白术内酯分子在树脂内部的扩散，导致树脂吸附率有所下降。但即使在第4种浓度下，白术内酯III吸附率仍能达87.91%，说明用4种浓度上样均可。总体来看，上样液浓度越大，树脂的吸附量越大、利用率也亦高。但试验中发现，上样液浓度越大浑浊度愈越大，不仅给后面的试验带来麻烦，且造成原料浪费。综合考虑，确定以白术内酯III质量浓度为主要参考，不宜超过60 μg/mL。
2.2.2 上样流速对吸附效果的影响 。
试验中所选的4种流速，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ的吸附率均达100.00%，表明树脂吸附量尚未达到饱和状态；对白术内酯III的吸附率分别为94.43%、92.58%、87.70%和85.15%，表明随上样流速的增加吸附率下降。可能是因为流速较快时，白术内酯III与树脂的接触时间较短，来不及扩散到树脂内部并被吸附便流出，仅仅靠树脂表面的吸附使得吸附率降低。上样流速慢，白术内酯III分子有充足的时间与树脂的内表面接触，增加对白术内酯III的吸附，从而提高吸附率。但流速过慢时，耗时多，导致循环周期延长。上样流速由2 BV/h 增加至3 BV/h时，吸附率由92.58%下降至87.70%。综合考虑，确定上样流速为2 BV/h。
2.2.3 最大上样量考察。
由图3可知，用白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为11.4和29.9 μg/mL上样液、以1 BV/h上样，在26 BV时流出液中白术内酯III开始泄露（泄漏点是流出液中白术内酯浓度为上样浓度的1/10），此时白术内酯Ⅰ尚处于未饱和状态。最终确定该条件下D101的最大上样量（以白术内酯III为准）为26 BV。 2.3 动态解吸参数考察
2.3.1 洗脱流速对洗脱效果的影响。
用4 BV体积分数为75%的乙醇为洗脱剂，以1、2、3、4 BV/h流速进行洗脱，白术内酯Ⅰ的洗脱率分别为70.95%、70.27%、68.92%和53.38%，白术内酯III的分别为93.69%、87.54%、76.62%和68.86%，表明随洗脱流速的增大洗脱效果下降，白术内酯Ⅰ的下降较缓，白术内酯III的下降较明显，总体来看，速度越慢洗脱效果越好。这可能是因为流速太快，洗脱剂未能与被吸附的白术内酯进行充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出。但流速过低，洗脱时间较长。考虑工作效率和综合试验结果，该研究确定洗脱流速为2 BV/h。
2.3.2 乙醇体积分数对洗脱效果的影响。
大孔树脂吸附法是根据被分离物质与树脂之间吸附力强弱来选择不同的洗脱剂和相应的洗脱剂浓度。对于极性都小的大孔树脂和被分离的物质分子来说，洗脱剂极性越小，洗脱效果越好。考虑到白术内酯通常应用于医药行业中，因此该试验选用无毒性的乙醇作为洗脱剂。白术内酯Ⅰ和III均为弱极性分子，D101为非极性大孔树脂，因此，乙醇的体积分数越大洗脱效果越好。
由图4可知，体积分数为30%乙醇不能将白术内酯Ⅰ和III从树脂上洗脱下来，50%和75%乙醇均能将白术内酯Ⅰ和III从树脂上洗脱下来，后者的洗脱效果明显好于前者。90%乙醇对白术内酯Ⅰ和III的洗脱效果更高些，但相应洗脱下的脂溶性杂质增多，产品中白术内酯Ⅰ和III含量降低且带色。因此，确定洗脱剂用75%乙醇。
2.3.3 洗脱剂用量。
由图5 可知，对于白术内酯III动态洗脱曲线，峰单一、尖锐、对称，且没有明显的拖尾现象，洗脱高峰相对集中在7～12 BV；白术内酯Ⅰ动态洗脱曲线较平缓，有拖尾现象。用6 BV 75%乙醇基本能将白术内酯III从D101大孔树脂上洗脱下来，回收率98.24%，此时白术内酯Ⅰ的回收率为96.67%，若再增加5 BV洗脱剂，白术内酯Ⅰ的回收率>100.00%。
2.4 大孔树脂重复使用次数的考察一般情况下，大孔树脂在重复使用多次后，因吸附物质会引起树脂中毒。从表2可看出，树脂随着重复使用次数的增加，白术内酯回收率虽然有所下降，但重复使用了8次，白术内酯III的回收率仅减少不到4%，白术内酯Ⅰ稍多些，也减少不到8%。说明此工艺树脂中毒现象较轻，适合白术内酯的重复分离。
3 结论与讨论
通过比较白术内酯Ⅰ和III静态吸附和解吸效果，从6种大孔吸附树脂中筛选出D101树脂适用于这2种白术内酯的富集。最佳工艺参数：湿法装成径高比1∶6的树脂柱，白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为25.6和59.7 μg/mL的上样液4 BV，以2 BV/h流速上样，依次用大量（15 BV以上）水和6BV 30%乙醇洗涤树脂，除去上样液和杂质，再用12 VB 75%乙醇以2 BV/h洗脱，此条件下白术内酯Ⅰ和III的回收率分别达100.00%和98.24%。
该试验与文献[19]的差异是：首先增加了一个考察指标白术内酯Ⅰ，因为白术内酯Ⅰ也是白术的主要活性；其次证明了D101树脂也适合于白术内酯的分离纯化；第三，白术粗提液的制法不同，该研究用乙醇为溶媒、超声辅助提取法，因为白术内酯Ⅰ和III均为弱极性分子，在乙醇中的溶解度大于在水中的；超声辅助提取法具有快速、省时、节能、高效等优点。该试验证明，欲制备质量浓度相同的白术内酯III粗提液，时间和白术药材均比文献[19]的方法极大地节省，操作程序简化。
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关键词 白术；白术内酯；富集；大孔树脂；工艺条件
中图分类号 R284.1；R282.71 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）24-131-05
Abstract[Objective] To research the enrichment process of atractylconolide Ⅰ and III with Atracttylodes macrocephala Koidz as the research materials.[Method] The enrichment effects of 6 different macroporous resins were compared by static adsorption and desorption experiments.Dynamic test was carried out on the best macroporous resin.[Result] The optimal technology of atractylconolide Ⅰ and III enrichment by D101 macroporous resin was as follows：mass concentrations of atractylcnolideⅠand III were 25.6.2 and 59.7 μg/mL，respectively； 4 BV sample volume，2 BV/h flow rate，eluting with 16 BV water，6 BV 30% ethanol and 12 BV 75% ethanol in turn.Under this condition，the the recovery rate of atractylcnolideⅠand III were up to 100.00% and 98.24%，respectively.[Conclusion] It is a simple and effective enrichment process of atractylcnolide from crude extracts of Atracttylodes macrocephala Koidz by D101 macroporous.
AbstractAtracttylodes macrocephala Koidz； Atractylenolide； Enrichment； Macroporous resin； Technology condition
白术为菊科（Compositae）植物白术（Atracttylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎，是我国传统中药之一，具有健脾、益气、安胎、止汗等功效，常用于脾虚食少、腹胀泄泻、胎动不安、自汗等症[1]。随着对白术研究的深入，证实其还具有降血糖、免疫调节、镇痛、抑制代谢活化酶、抗肿瘤等活性[2-4]。白术内酯Ⅰ和III是白术的有效成分，也是白术质量控制的主要指标[5-7]。但白术中白术内酯Ⅰ和III的含量较少，直接从白术提取的粗提物中白术内酯Ⅰ和III含量低[8-9]，不能满足医药行业的要求。因此，从白术粗提物中高效、快速地富集得到一定含量的白术内酯Ⅰ和III产品，具有很高的经济价值与现实意义。
大孔树脂具有吸附容量大、选择性高、可再生循环使用、工艺简单、不存在金属和有机溶剂毒性残留[10]等优点，已广泛应用于中药有效成分如黄酮、生物碱、多糖、皂苷等的富集纯化中[11-14]。从白术中提取白术内酯Ⅰ和III工艺研究已有不少报道[15-18]，但用大孔树脂富集纯化白术内酯Ⅰ和III的相关研究报道很少，仅李鸿翔等[19]尝试用AB-8 型大孔树脂分离纯化白术水提液中白术内酯III，且取得良好的效果。该研究以白术为材料，通过静态吸附和解吸比较6种大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的富集效果，对效果好的大孔树脂进行动态试验，研究2种白术内酯的富集工艺条件。
1 材料与方法
1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国惠普公司）；BSA124S型电子天平（北京慧龙环科环境仪器有限公司）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QHZ-98B全温光照振荡培养箱（江苏省太仓市美华生化仪器厂）。
1.2 试材 白术内酯Ⅰ和III对照品（购自贵州省迪大科技有限责任公司，批号分别为GZ73069-12-3和GZ73030-71-4，纯度均大于99%）；白术购于贵阳药材市场，经贵阳中医学院席先蓉教授鉴定为白术（Atracttylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎。D101、NKA、X-5、H107、DM130、AB-8大孔树脂（湖南长沙大禹化工有限公司）。甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，乙醇为食用级，其余试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 白术内酯含量测定
1.3.1.1 对照品储备液的制备。分别精密称取白术内酯Ⅰ和III对照品2.0和4.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成白术内酯Ⅰ和III浓度分别为0.08和0.16 mg/mL的混合对照品储备液。 1.3.1.2 白术内酯粗提液的制备。称取适量白术药材粉末（过20目筛），加12倍体积分数85%乙醇，50 ℃超声提取2次，每次30 min，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，用体积分数为5%乙醇配成所需浓度，减压过滤，得黄色稍浑滤液，即白术粗提液。
1.3.1.3 色谱条件。ZORBAXSB.C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=65∶35；流速1.0 mL/min；检测波长220 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。在此条件下，色谱图见图1。
1.3.1.4 标准曲线的绘制。
分别精密吸取对照品储备液0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得白术内酯Ⅰ浓度分别为0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL和白术内酯III浓度分别为1.6、4.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL的对照品溶液。在“1.3.1.3”色谱条件下进行分析。以白术内酯质量浓度（μg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，求得白术内酯Ⅰ和III的回归方程分别为Y=38.822X+16.016（R2=0.999 9）、Y=27.333X+31.197（R2=0.999 9），表明白术内酯Ⅰ和III分别在0.8～80.0、1.6～160.0μg/mL范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系。
1.3.1.5 方法学考察。
（1）精密度试验。精密吸取对照品储备液10 μL，重复进样5次，白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为0.77%和0.55%，表明仪器精密度良好。
（2）稳定性试验。取白术内酯粗提液，分别于0、1、2、4、8、12、24 h内测定，在8 h内白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为1.63%和1.68%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
（3）重复性试验。精密称取同一批次白术药材粉末5份，按“1.3.1.2”制备白术内酯粗提液，按“1.3.1.3”色谱条件测定其含量，测得白术内酯Ⅰ和III的RSD分别为1.36%和1.40%，表明该方法重复性良好。
（4）加样回收率试验。精密称取已测知白术内酯Ⅰ和III含量的白术药材粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量的白术内酯Ⅰ和III对照品，按“1.3.1.2”制备白术内酯粗提液，按“1.3.1.3”色谱条件测定其含量，白术内酯Ⅰ的平均回收率为99%，RSD为1.63%，白术内酯III的平均回收率为98%，RSD为2.13%，表明该方法的回收率较好。
1.3.2 富集工艺优选。
1.3.2.1 大孔树脂的预处理。
新大孔树脂用95%的乙醇浸泡24 h，过滤，再用95%的乙醇冲洗至洗脱液与蒸馏水以1∶1混合清亮为止，然后用水洗至洗脱液无乙醇味，蒸干后无残余物，用水浸泡备用。
1.3.2.2 静态法筛选大孔树脂。
准确称取6种已处理好的大孔树脂各2.0 g （用注射器抽干水分后称重），置250 mL具塞锥形瓶中，各加入一定浓度的白术提取液100 mL，将具塞锥形瓶置于摇床，25 ℃恒温振荡24 h （80 r/min ），充分吸附后，过滤，测定滤液中白术内酯Ⅰ和III的含量。同时称取相同质量的各树脂，在105 ℃下干燥至恒重，测定各树脂的含水率，并计算其吸附量。按下列公式计算各种树脂静态吸附率：
式中，Q为吸附量（μg/g）；E为吸附率；C0为上样液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；C1为吸附平衡后滤液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；V为上样液体积（mL），M为树脂质量（g）。
将上述吸附饱和的6种大孔树脂用适量水洗涤，除去白术内酯提取液，然后加入50 mL水，于25 ℃恒温振荡120 min，过滤，并用注射器抽干水分。准确加入体积分数95%的乙醇溶液50 mL，25 ℃恒温振荡（ 80 r/min ）解吸24 h，过滤。精密移取滤液各10 mL，减压除尽溶剂，残余物用5%乙醇定容至10 mL，测定白术内酯Ⅰ和III的含量，按下列公式计算各种树脂静态解吸率：
式中，B为解吸率；C2为解吸液中白术内酯Ⅰ或III的质量浓度（μg/mL）；V1为解吸剂体积（mL）。
1.3.2.3 静态吸附动力学测定。
根据上述试验结果，筛选吸附和解吸效果好的2种大孔树脂进行动力学考察。精密称取大孔树脂2.0 g，放入250 mL具塞三角瓶中，加入白术内酯提取液100 mL（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为9.1和32.2 μg/mL），25 ℃恒温振荡（80 r/min ），在7 h内，每0.5 h取0.5 mL，取8份，然后每1 h取0.5 mL，测其白术内酯含量，绘制静态吸附动力学曲线，确定静态吸附平衡时间。
1.3.2.4 柱条件的优选。
（1）上样液浓度考察。称取D101大孔树脂4 份，湿法装成径高比为1∶6的树脂柱，取4种不同浓度白术内酯提取液各4 BV（白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为5.1和11.2、11.6和27.6、15.3和43.9、24.5和58.7 μg/mL，试验编号依次为1、2、3、4），以2 BV/h的流速分别通过4根树脂柱，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的吸附率，优选出最佳上样液浓度。
（2）上样流速考察。取4根径高比为1∶6的 D101大孔树脂柱，分别以1、2、3、4 BV/h的流速连续加入4 BV白术内酯提取液（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为16.3和43.1 μg/mL），待提取液全部通过树脂柱后，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的吸附率，优选出最佳上样流速。 （3）最大上样量考察。取1根径高比为1∶6的 D101大孔树脂柱，以1 BV/h的流速连续加入白术提取液（白术内酯Ⅰ和III的含量分别为11.4和29.9 μg/mL），每份收集1 BV，测定白术内酯含量，以收集份数为横坐标、流出液中白术内酯质量浓度为纵坐标作图，根据泄漏情况得出最大上样量。
1.3.2.5 洗脱条件的优选。
（1）洗脱流速考察。取已知吸附量的4根树脂柱，先用适量去离子水（约16 BV）洗涤树脂至流出液为无色透明，再用4 BV体积分数为75%的乙醇为洗脱剂，分别以1、2、3、4 BV/h流速洗脱，待洗脱剂全部通过树脂后，测定流出液白术内酯含量，计算白术内酯的洗脱率，优选出最佳洗脱流速。
（2）洗脱剂浓度考察。取已知吸附量的1根树脂柱，先用适量去离子水洗涤树脂至流出液为无色透明，再依次用2 BV体积分数30%、50%和75%乙醇，以2 BV/h流速洗脱，每份收集1 BV，测定白术内酯含量，计算白术内酯的洗脱率，优选出最佳洗脱剂浓度。
（3）洗脱剂用量考察。取已知吸附量、并用去离子水洗去提取液的树脂柱1根，用75%乙醇以2 BV/ h流速进行洗脱，每份收集1 BV，测定流出液白术内酯含量，以收集份数为横坐标、流出液中白术内酯质量浓度为纵坐标作图，得出洗脱剂用量。
1.3.2.6 大孔树脂重复使用次数的考察。①按优选出工艺参数进行上样和洗脱，考察大孔树脂重复使用次数。为了提高工作效率，洗脱流程稍作简化，即先用大量水冲洗掉大孔树脂柱中白术提取液，然后只用3 BV的30%乙醇除杂、8 BV的75%乙醇洗脱。②大孔树脂再生，用10 BV 95%乙醇树脂浸泡3次，每次1 h，再用10 BV 95%乙醇浸泡24 h，最后用水洗至无醇味。按①和②重复操作。
2 结果与分析
2.1 大孔树脂的筛选
2.1.1 大孔树脂静态吸附-解吸比较。影响大孔树脂吸附性能的因素有很多，通常大孔树脂的结构、极性、粒径、比表面积、孔径以及被吸附分子大小、结构、极性等是影响吸附性能的重要因素，不同型号的树脂，由于结构、极性等存在差异，导致对被吸附分子吸附、解吸的难易程度也不同。为寻找适合富集白术内酯的树脂，该试验选取D101、NKA、H107、X-5、DM130、AB-8大孔树脂对白术粗提液进行处理，运用静态吸附和解吸试验进行筛选。
由表1可知，6种大孔树脂对白术内酯吸附率和解吸率存在差异，说明大孔树脂对白术内酯的吸附、解吸有一定的选择性。综合考虑吸附和解吸情况，6种大孔树脂中D101、NKA和AB-8对白术内酯Ⅰ和III情况相当且效果最佳。李鸿翔等[19]已用AB-8对白术内酯III的分离纯化进行了研究，该试验选定D101和NKA大孔树脂进行进一步考察。
2.1.2 静态吸附动力学考察。
单用大孔树脂的静态吸附率和解吸率来评价其性能不是很全面，还应该考虑其吸附速度，所以需研究其静态吸附动力学特征。由图2可知，在0～0.5 h内，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的吸附较快，随后吸附速度减缓，白术内酯III在4 h时吸附基本达到平衡，白术内酯Ⅰ在4.5 h时吸附基本达到平衡。NKA大孔树脂对白术内酯Ⅰ和III的吸附情况与D101相似，但在5 h 时吸附才基本达到平衡，因此，确定用D101大孔树脂富集白术粗提物中的白术内酯。
2.2 D101树脂动态吸附试验
2.2.1 上样液浓度对吸附效果的影响。
大孔树脂吸附目标分子时存在一个吸附平衡，该平衡与上样液质量浓度有很大关系。试验中所选的4种质量浓度白术提取液，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ的吸附率均达100.00%，表明树脂吸附量尚未达到饱和状态；对白术内酯III的吸附率分别为100.00%、100.00%、92.48%和87.91%，表明在白术内酯III浓度较低的情况下，增加浓度（由11.2 μg/mL升至27.6 μg/mL），吸附率仍能达100.00%。这是因为浓度较低时，提高上柱液浓度可增加白术内酯分子与树脂的接触，加速白术内酯分子进入树脂内部并迅速扩散，随着浓度的提高树脂的吸附量也随之增加，吸附率保持不变。但若浓度再提高，如由27.6 μg/mL增加至43.9 μg/mL甚至58.7 μg/mL，吸附率随之而减少。因为随着浓度的再增大，被吸附的杂质量也随之加大，同时树脂接触表面白术内酯分子过多，阻碍其他白术内酯分子进入树脂内部，影响白术内酯分子在树脂内部的扩散，导致树脂吸附率有所下降。但即使在第4种浓度下，白术内酯III吸附率仍能达87.91%，说明用4种浓度上样均可。总体来看，上样液浓度越大，树脂的吸附量越大、利用率也亦高。但试验中发现，上样液浓度越大浑浊度愈越大，不仅给后面的试验带来麻烦，且造成原料浪费。综合考虑，确定以白术内酯III质量浓度为主要参考，不宜超过60 μg/mL。
2.2.2 上样流速对吸附效果的影响 。
试验中所选的4种流速，D101大孔树脂对白术内酯Ⅰ的吸附率均达100.00%，表明树脂吸附量尚未达到饱和状态；对白术内酯III的吸附率分别为94.43%、92.58%、87.70%和85.15%，表明随上样流速的增加吸附率下降。可能是因为流速较快时，白术内酯III与树脂的接触时间较短，来不及扩散到树脂内部并被吸附便流出，仅仅靠树脂表面的吸附使得吸附率降低。上样流速慢，白术内酯III分子有充足的时间与树脂的内表面接触，增加对白术内酯III的吸附，从而提高吸附率。但流速过慢时，耗时多，导致循环周期延长。上样流速由2 BV/h 增加至3 BV/h时，吸附率由92.58%下降至87.70%。综合考虑，确定上样流速为2 BV/h。
2.2.3 最大上样量考察。
由图3可知，用白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为11.4和29.9 μg/mL上样液、以1 BV/h上样，在26 BV时流出液中白术内酯III开始泄露（泄漏点是流出液中白术内酯浓度为上样浓度的1/10），此时白术内酯Ⅰ尚处于未饱和状态。最终确定该条件下D101的最大上样量（以白术内酯III为准）为26 BV。 2.3 动态解吸参数考察
2.3.1 洗脱流速对洗脱效果的影响。
用4 BV体积分数为75%的乙醇为洗脱剂，以1、2、3、4 BV/h流速进行洗脱，白术内酯Ⅰ的洗脱率分别为70.95%、70.27%、68.92%和53.38%，白术内酯III的分别为93.69%、87.54%、76.62%和68.86%，表明随洗脱流速的增大洗脱效果下降，白术内酯Ⅰ的下降较缓，白术内酯III的下降较明显，总体来看，速度越慢洗脱效果越好。这可能是因为流速太快，洗脱剂未能与被吸附的白术内酯进行充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出。但流速过低，洗脱时间较长。考虑工作效率和综合试验结果，该研究确定洗脱流速为2 BV/h。
2.3.2 乙醇体积分数对洗脱效果的影响。
大孔树脂吸附法是根据被分离物质与树脂之间吸附力强弱来选择不同的洗脱剂和相应的洗脱剂浓度。对于极性都小的大孔树脂和被分离的物质分子来说，洗脱剂极性越小，洗脱效果越好。考虑到白术内酯通常应用于医药行业中，因此该试验选用无毒性的乙醇作为洗脱剂。白术内酯Ⅰ和III均为弱极性分子，D101为非极性大孔树脂，因此，乙醇的体积分数越大洗脱效果越好。
由图4可知，体积分数为30%乙醇不能将白术内酯Ⅰ和III从树脂上洗脱下来，50%和75%乙醇均能将白术内酯Ⅰ和III从树脂上洗脱下来，后者的洗脱效果明显好于前者。90%乙醇对白术内酯Ⅰ和III的洗脱效果更高些，但相应洗脱下的脂溶性杂质增多，产品中白术内酯Ⅰ和III含量降低且带色。因此，确定洗脱剂用75%乙醇。
2.3.3 洗脱剂用量。
由图5 可知，对于白术内酯III动态洗脱曲线，峰单一、尖锐、对称，且没有明显的拖尾现象，洗脱高峰相对集中在7～12 BV；白术内酯Ⅰ动态洗脱曲线较平缓，有拖尾现象。用6 BV 75%乙醇基本能将白术内酯III从D101大孔树脂上洗脱下来，回收率98.24%，此时白术内酯Ⅰ的回收率为96.67%，若再增加5 BV洗脱剂，白术内酯Ⅰ的回收率>100.00%。
2.4 大孔树脂重复使用次数的考察一般情况下，大孔树脂在重复使用多次后，因吸附物质会引起树脂中毒。从表2可看出，树脂随着重复使用次数的增加，白术内酯回收率虽然有所下降，但重复使用了8次，白术内酯III的回收率仅减少不到4%，白术内酯Ⅰ稍多些，也减少不到8%。说明此工艺树脂中毒现象较轻，适合白术内酯的重复分离。
3 结论与讨论
通过比较白术内酯Ⅰ和III静态吸附和解吸效果，从6种大孔吸附树脂中筛选出D101树脂适用于这2种白术内酯的富集。最佳工艺参数：湿法装成径高比1∶6的树脂柱，白术内酯Ⅰ和III质量浓度分别为25.6和59.7 μg/mL的上样液4 BV，以2 BV/h流速上样，依次用大量（15 BV以上）水和6BV 30%乙醇洗涤树脂，除去上样液和杂质，再用12 VB 75%乙醇以2 BV/h洗脱，此条件下白术内酯Ⅰ和III的回收率分别达100.00%和98.24%。
该试验与文献[19]的差异是：首先增加了一个考察指标白术内酯Ⅰ，因为白术内酯Ⅰ也是白术的主要活性；其次证明了D101树脂也适合于白术内酯的分离纯化；第三，白术粗提液的制法不同，该研究用乙醇为溶媒、超声辅助提取法，因为白术内酯Ⅰ和III均为弱极性分子，在乙醇中的溶解度大于在水中的；超声辅助提取法具有快速、省时、节能、高效等优点。该试验证明，欲制备质量浓度相同的白术内酯III粗提液，时间和白术药材均比文献[19]的方法极大地节省，操作程序简化。
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