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摘 要：提取莱芜生姜总RNA，采用RT-PCR技术扩增出生姜蛋白酶（Ginger protease）基因GP2和GP3，经序列比对，发现莱芜生姜蛋白酶基因GP2在945位的碱基与Gene bank中生姜蛋白酶的序列GP2b（GI：57118006）有差異，GP3在451、700和804这3个位置的碱基与GP3b（GI：57118011）有差异，在翻译后的氨基酸也不同，表明了不同生姜品种生姜蛋白酶基因的多样性。将克隆的GP2片段GPII重组到带有His-tag的原核表达载体pET30a（+）中，构建重组表达载体pET-GPII。将重组pET-GPII转化到大肠杆菌BL21（DE3）中构建工程菌株，工程菌株用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，在诱导6 h，IPTG浓度为0.1 mmol/L时，重组GPII表达量最高。SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明蛋白大小约为21 kDa。该实验结果表明生姜蛋白酶能够在原核表达系统进行大量表达，为生姜蛋白酶工程化生产奠定了基础。
关键词：莱芜生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核细胞;表达
生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain，EC 3.4.22.67）是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶，有两种GP-I和GP-II（GPI和GPII分别与GenBank中GP3和GP2同源性较高），均含有221个氨基酸，含有6个Cys形成3个二硫键为糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白，可用于肉类嫩化、酒类澄清，乳制品凝固等[1]，以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在广东地区颇受欢迎，因此该酶具有良好的工业化应用前景[2]。
生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大，甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同，导致生姜蛋白酶的提取率不稳定[3]。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发，推升了市场上生姜的价格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。
本实验从莱芜生姜中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增生姜蛋白酶基因，并构建了pET-GPII原核表达载体，重组质粒在大肠杆菌BL21中实现了原核表达，为生姜蛋白酶工程化生产进行了探索。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种、质粒和植物材料
大肠杆菌DHB4和宿主菌BL21以及质粒pET30a（+）为本实验室保存，莱芜生姜购于莱芜大润发超市。
1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂
dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;植物总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司;T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反转录试剂盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit购自ThermoFisher公司;DNA凝胶回收试剂盒和DNA质粒提取试剂盒购自OMGEA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 生姜蛋白酶cDNA的合成
根据植物总RNA提取试剂盒操作说明分离提取生姜总RNA，将RNA利用反转录试剂盒合成cDNA并稀释至50 ng/?L。
1.2.2 引物的设计与合成
根据Gen Bank（NCBI）数据库中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI：57118005）和GP3a（GI：57118009）的上下游序列设计特异性引物，以生姜mRNA反转录产物（cDNA）为模板，PCR克隆生姜蛋白酶基因。两对特异性引物，分别为GP2a上游引物：5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3’，下游引物：5’-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’;GP3a上游引物：5’-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’，下游引物：5’-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’;GPII上游引物：5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’，下游引物：5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’。
1.2.3 生姜蛋白酶原核表达载体的构建
以稀释后的cDNA为模板，PCR扩增生姜蛋白酶基因。PCR反应程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶说明书执行。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。将回收的PCR产物交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序，并与Gene Bank上已发布的序列进行比对。以GP2序列为模板克隆GPII片段，并连接到表达载体pET30a（+）载体上转化感受态DHB4，经Kan+抗性的LB固体培养基筛选。挑取抗性重组子测序，将序列正确的克隆命名为pET-GPII。提取重组质粒转化BL21感受态细胞。
1.2.4 生姜蛋白酶表达条件优化
将携带重组表达载体pET-GPII的工程菌BL21在LB培养基上培养至OD600为0.4时，分别加入0～0.5 mmol/L不同浓度的IPTG，37 ℃诱导4 h，并通过SDS电泳分析IPTG浓度对诱导结果的差异。进一步在加入0.1 mmol/L的IPTG条件下诱导0～10 h不等的时间，分析不同诱导时间对诱导结果的差异。
2 结果与分析
2.1 生姜蛋白酶基因的克隆与原核表达载体构建
通过RT-PCR成功获得与目的基因大小相符的DNA片段。将该片段连接到原核表达载体pET-30a（+）并进行测序，GP2序列全长为1 146 bp，GP3为1 401 bp。序列比对发现与GP2与GP2b（GI：57118006）同源性为99.91%，仅在945位碱基发生改变，与GP2a（GI：57118005）相同位置的碱基一致。GP3与GP3b（GI：57118011）同源性为94.77%，有451、700和804这3个位置的碱基发生改变，与GP3a（GI：57118009）相同位置上的碱基一样（如图1所示），说明了不同品种生姜蛋白酶基因的多样性。进一步以GP2为模板，克隆出了726 bp的GPII片段[4]，并将其连接到原核表达载体pET-30a（+）构建重组表达载体pET-GPII。 2.2 生姜蛋白酶的诱导表达及诱导条件优化
将重组表达载体pET-GPII转化宿主菌BL21，培养单克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，浓度为0.05 mmol/L，发酵1 h，4 h，6 h和10 h，以未添加IPTG的pET-GPII的菌和转化空载体的菌为对照组，结果发现当诱导时间达到6 h以后，目的基因的蛋白表达量没有显著变化（图2A）。当加入不同浓度的IPTG时，发现0.1 mmol/L的IPTG诱导表达的蛋白量最多（图2B）;因此推断最佳诱导条件为37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG诱导6 h。
3 结论与讨论
近年来随着对生姜蛋白酶的深入研究，发现生姜蛋白酶对肉类具有良好的嫩化作用，对于酒类的澄清效率远高于木瓜蛋白酶，還可作为凝乳剂来制作风味乳品。用生姜蛋白酶制备的奶酪，口感好，无苦涩感[5-6]，说明生姜蛋白酶具有潜在的商业应用价值。
原核表达系统具有遗传背景清晰，细胞生长周期短，增殖速度快，发酵产量高，易于工程化等优点而受到欢迎，而且优化发酵条件可以使目的蛋白以可溶的形式生产。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表达系统中成功诱导表达，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG诱导条件下表达6 h产量最高。这为生姜蛋白酶工程化生产提供了理论基础。
参考文献
[1]冯敏，唐春红.生姜蛋白酶的研究概述[J].中国食品添加剂，2008（6）：58-60.
[2]李田叶，李旻，安建乐，等.响应面法优化生姜蛋白酶提取及酸奶中的应用[J].食品工业，2015，36（7）：91-95.
[3]代景泉，黄雪松.生姜蛋白酶的分离纯化[J].食品科学，2003（2）：73-79.
[4]MISOOK Kim，Hamilton S E.，Guddat L W.，et al.Plant collagenase：Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007，1770（12）：1627-1635.
[5]黄冬香，李小华，李林，等.生姜蛋白酶的研究进展及其在食品加工中的应用[J].食品工业科技，2009，30（12）：406-409.
[6]范金波，侯宇，黄训文，等.生姜蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究[J].食品与发酵工业，2014，40（5）：65-69.
关键词：莱芜生姜;生姜蛋白酶;克隆;原核细胞;表达
生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain，EC 3.4.22.67）是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶，有两种GP-I和GP-II（GPI和GPII分别与GenBank中GP3和GP2同源性较高），均含有221个氨基酸，含有6个Cys形成3个二硫键为糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白，可用于肉类嫩化、酒类澄清，乳制品凝固等[1]，以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在广东地区颇受欢迎，因此该酶具有良好的工业化应用前景[2]。
生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大，甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同，导致生姜蛋白酶的提取率不稳定[3]。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发，推升了市场上生姜的价格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。
本实验从莱芜生姜中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增生姜蛋白酶基因，并构建了pET-GPII原核表达载体，重组质粒在大肠杆菌BL21中实现了原核表达，为生姜蛋白酶工程化生产进行了探索。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种、质粒和植物材料
大肠杆菌DHB4和宿主菌BL21以及质粒pET30a（+）为本实验室保存，莱芜生姜购于莱芜大润发超市。
1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂
dNTP、DL2000、EasyTaq DNA聚合酶、TransStart FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;植物总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司;T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶KpnI、XbaI、EcoRI和反转录试剂盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit购自ThermoFisher公司;DNA凝胶回收试剂盒和DNA质粒提取试剂盒购自OMGEA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 生姜蛋白酶cDNA的合成
根据植物总RNA提取试剂盒操作说明分离提取生姜总RNA，将RNA利用反转录试剂盒合成cDNA并稀释至50 ng/?L。
1.2.2 引物的设计与合成
根据Gen Bank（NCBI）数据库中生姜半胱氨酸蛋白酶基因GP2a（GI：57118005）和GP3a（GI：57118009）的上下游序列设计特异性引物，以生姜mRNA反转录产物（cDNA）为模板，PCR克隆生姜蛋白酶基因。两对特异性引物，分别为GP2a上游引物：5’-ATTAGGATCCATGGCTTCCACCGTAGACAAT-3’，下游引物：5’-ATTAAAGCTTTGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’;GP3a上游引物：5’-ATTTGGATCCATGGCTTCCTTCGTCGC-3’，下游引物：5’-ATTAGTCGACTGCACTGCTCTTCAGACC-3’;GPII上游引物：5’-ATTAGAATTCGCTCCCTATCAGGATGTCCTGA-3’，下游引物：5’-ATTATCTAGATGCACTGCTCTTGAGACCTCC-3’。
1.2.3 生姜蛋白酶原核表达载体的构建
以稀释后的cDNA为模板，PCR扩增生姜蛋白酶基因。PCR反应程序按照TransStart FastPfu DNA聚合酶说明书执行。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。将回收的PCR产物交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序，并与Gene Bank上已发布的序列进行比对。以GP2序列为模板克隆GPII片段，并连接到表达载体pET30a（+）载体上转化感受态DHB4，经Kan+抗性的LB固体培养基筛选。挑取抗性重组子测序，将序列正确的克隆命名为pET-GPII。提取重组质粒转化BL21感受态细胞。
1.2.4 生姜蛋白酶表达条件优化
将携带重组表达载体pET-GPII的工程菌BL21在LB培养基上培养至OD600为0.4时，分别加入0～0.5 mmol/L不同浓度的IPTG，37 ℃诱导4 h，并通过SDS电泳分析IPTG浓度对诱导结果的差异。进一步在加入0.1 mmol/L的IPTG条件下诱导0～10 h不等的时间，分析不同诱导时间对诱导结果的差异。
2 结果与分析
2.1 生姜蛋白酶基因的克隆与原核表达载体构建
通过RT-PCR成功获得与目的基因大小相符的DNA片段。将该片段连接到原核表达载体pET-30a（+）并进行测序，GP2序列全长为1 146 bp，GP3为1 401 bp。序列比对发现与GP2与GP2b（GI：57118006）同源性为99.91%，仅在945位碱基发生改变，与GP2a（GI：57118005）相同位置的碱基一致。GP3与GP3b（GI：57118011）同源性为94.77%，有451、700和804这3个位置的碱基发生改变，与GP3a（GI：57118009）相同位置上的碱基一样（如图1所示），说明了不同品种生姜蛋白酶基因的多样性。进一步以GP2为模板，克隆出了726 bp的GPII片段[4]，并将其连接到原核表达载体pET-30a（+）构建重组表达载体pET-GPII。 2.2 生姜蛋白酶的诱导表达及诱导条件优化
将重组表达载体pET-GPII转化宿主菌BL21，培养单克隆菌落至OD600=0.4，然后添加IPTG，浓度为0.05 mmol/L，发酵1 h，4 h，6 h和10 h，以未添加IPTG的pET-GPII的菌和转化空载体的菌为对照组，结果发现当诱导时间达到6 h以后，目的基因的蛋白表达量没有显著变化（图2A）。当加入不同浓度的IPTG时，发现0.1 mmol/L的IPTG诱导表达的蛋白量最多（图2B）;因此推断最佳诱导条件为37 ℃，0.1 mmol/L，IPTG诱导6 h。
3 结论与讨论
近年来随着对生姜蛋白酶的深入研究，发现生姜蛋白酶对肉类具有良好的嫩化作用，对于酒类的澄清效率远高于木瓜蛋白酶，還可作为凝乳剂来制作风味乳品。用生姜蛋白酶制备的奶酪，口感好，无苦涩感[5-6]，说明生姜蛋白酶具有潜在的商业应用价值。
原核表达系统具有遗传背景清晰，细胞生长周期短，增殖速度快，发酵产量高，易于工程化等优点而受到欢迎，而且优化发酵条件可以使目的蛋白以可溶的形式生产。本研究成功克隆了生姜蛋白酶基因，并在原核表达系统中成功诱导表达，在37 ℃，0.1 mmol/L IPTG诱导条件下表达6 h产量最高。这为生姜蛋白酶工程化生产提供了理论基础。
参考文献
[1]冯敏，唐春红.生姜蛋白酶的研究概述[J].中国食品添加剂，2008（6）：58-60.
[2]李田叶，李旻，安建乐，等.响应面法优化生姜蛋白酶提取及酸奶中的应用[J].食品工业，2015，36（7）：91-95.
[3]代景泉，黄雪松.生姜蛋白酶的分离纯化[J].食品科学，2003（2）：73-79.
[4]MISOOK Kim，Hamilton S E.，Guddat L W.，et al.Plant collagenase：Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger[J].2007，1770（12）：1627-1635.
[5]黄冬香，李小华，李林，等.生姜蛋白酶的研究进展及其在食品加工中的应用[J].食品工业科技，2009，30（12）：406-409.
[6]范金波，侯宇，黄训文，等.生姜蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究[J].食品与发酵工业，2014，40（5）：65-69.