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摘要：对成年藏羊进行O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘组合和口蹄疫、小反刍兽疫、布鲁氏菌病组合联合免疫，与单苗免疫效果进行比较。结果显示，2种组合的安全性较好，未发生明显免疫副反应，同时表现出了与单苗一致或稍好于单苗的免疫效果，抗体合格率达到或超过了国家规定的70%的标准，相互干扰和拮抗作用不明显。
关键词：藏羊;多疫苗联合免疫;单苗免疫
中图分类号：S858.26 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2021）07-0013-04
随着分子生物学、细胞生物学、医学生物技术等相关学科的飞速发展，新疫苗不断被研究和开发，疫苗种类大量增加。截至2005年底，我国已经生产使用的人用疫苗多达40余种。疫苗数量的增多，在预防多种传染病的同时，也伴随着一系列问题的产生，如儿童预防接种次数增加、疫苗管理难度加大、预防接种工作成本增高等。因此，开发并推广应用一剂可以预防多病的联合疫苗势在必行[1]。在家畜疫病防控方面，也面临同样问题，做到一剂可以预防多病的联合疫苗开发较少，目前常见的有羊四联疫苗、羊痘-小反刍兽疫苗等极少数疫苗。
随着羊肉价格的提高，海晏县高原型藏羊（以下统称藏羊）养殖发展迅速，流通日益频繁，导致藏羊疫病日趋复杂化，疫病防控难度增大。统计表明，海晏县藏羊每年注射病毒类、细菌类及寄生虫类疫苗近10种，需要抓羊进行预防注射及驱虫次数在12次以上，虽然通过注射栏建设等能够缓解免疫注射过程中的部分劳动力不足等问题，但依然存在农牧民防疫过程中抓羊负担重、基层防疫员免疫工作任务多等问题，增加了养殖成本，降低了经济效益。为探讨藏羊免疫新方法，创新免疫程序，降低免疫成本，减少应激反应，提高经济效益，对O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病等4种青海省强制性免疫疫苗的联合免疫与单苗免疫进行了对比试验，以期为多疫苗联合免疫和兽用联合疫苗的开发研究提供相关理论依据。
1 试验区基本情况
96351牧场位于海晏县东部，草原面积4万hm2，属高寒草甸草场。全场年存栏藏羊4.8万只，年产羔羊3万余只。根据地理布局牧场分为3个牧业生产大队，属集体管理体制。藏羊饲养采取放牧为主，冬春季节适量补饲玉米（按每只0.2 kg/d补饲），不同年龄、性别单独组群，统一生产、统一疫病预防的饲养管理方法。
2 材料与方法
2.1 试验时间与材料
2.1.1 试验时间及地点 2019年9月至2020年3月在96351部队牧场三大队进行。
2.1.2 供试藏羊 牧场三大队一牧户6岁经产母羊群，饲养数量550余只。选择有角、大小基本一致、膘情较好、临床检查健康母羊120只，在耳根皮下埋入电子耳标，同时在羊角涂抹油漆加以区分不同分组。
2.1.3 供试疫苗 中农威特生物科技股份有限公司生产的口蹄疫O型灭活疫苗，生产批号F190706J;新疆天康生物股份有限公司生产的小反刍兽疫活疫苗，生产批号2018037-2;青海生物药品有限公司生产的羊痘活疫苗，生產批号201822;乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂生产的布鲁氏菌活疫苗（S2株），生产批号190101。
2.1.4 检测试剂盒 O型口蹄疫液相阻断ELIAS抗体检测试剂盒、小反刍兽疫竞争ELIAS检测试剂盒、羊痘间接ELIAS抗原检测试剂盒均购自中国农业科学院兰州兽医研究所、批号分别为20200602133（10126）、20200527118、2020090419-1。布鲁氏菌竞争ELIAS抗体检测试剂盒，由广州悦洋生物技术有限公司生产，批号EB0220006，均在有效期内。
2.2 试验方法
2.2.1 试验分组 试验组分为A、B两组，每组藏羊30只，共60只。其中，A组同时在颈部、臀部和尾根皮内注射口蹄疫、小反刍兽疫及羊痘3种疫苗，B组同时在两侧颈部、臀部皮内注射口蹄疫、小反刍兽疫及布鲁氏菌病3种疫苗;对照组藏羊共60只，随机分4个小组，每组15只，分别注射口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病疫苗。
2.2.2 疫苗注射 每个组合3种疫苗由3人负责注射，分别在两侧颈部、臀部或尾根皮内进行注射，剂量按照说明书要求足量注射;注射部位进行剪毛、消毒处理，注射针头做到一畜一针。
2.2.3 免疫副反应观察 注苗后安排专人观察试验藏羊精神、采食、运动等状况，连续观察7 d。
2.2.4 采血及血清分离 所有羊只第1个月分别采集注射疫苗前和注射疫苗后7、14、21、28 d的颈静脉血液，从第2个月开始每月采血1次，连续采集6个月，每次采集血液量不少于5 mL，血清分离后在 -20 ℃冰箱保存待检。
2.2.5 实验室检测 对O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘、布鲁氏菌均采用ELIAS方法进行血清抗体水平检测。根据ELIAS检测试剂盒说明书进行检测，对检测数据进行详细记录并统计分析。
3 结果与分析
3.1 免疫副反应观察
供试羊注射疫苗1 d后临床抽检，注射部位稍有红肿，精神稍差，但均未出现明显的精神不振、饮食欲减退、行动缓慢或跛行等副反应，也未发现应激死亡羊只。
3.2 O型口蹄疫免疫抗体水平检测结果
由表1可见，A、B 两组口蹄疫抗体水平均在注射疫苗7 d后迅速而稳步上升，达到70%以上的阳性率，而对照组7 d后阳性率仅为57.14%。注射疫苗后，试验A、B 组抗体水平相较于对照组明显更高且稳定。
3.3 小反刍兽疫免疫抗体水平
试验藏羊在2019秋季防疫注射了小反刍疫苗，由表2可见，对照组和试验A、 B组小反刍兽疫抗体水平在注射疫苗前均处于100%高水平状态。注射疫苗后第184天时抗体水平仍处于稳定和持续的高水平状态。 3.4 布鲁氏菌病抗体水平
由表3可见，羊群藏羊在2018年秋季注射布鲁氏菌病S2号疫苗后，到次年秋季仍然达到了60%以上的抗体阳性率。试验组藏羊注射疫苗后在第7天时抗体阳性率已达100%，对照组在第15天时阳性率达到100%。2个组第184天时抗体阳性率依然维持在极高的水平。
3.5 羊痘免疫抗体水平
该牧户羊群在2018年秋季防疫期间进行了羊痘疫苗的免疫接种，从表4可以看出，试验羊在免疫前羊痘的抗体水平处于较高水平，注射疫苗后一直维持较高的抗体阳性率。
4 小结与讨论
（1）陈泳等〔2〕用正向间接血凝法对新疆绵羊进行了O型口蹄疫苗抗体消长情况研究，结果显示免疫后30 d抗体阳性率达到98.6%，150 d后降到73%。姚菊霞等〔3〕研究表明，绵羊进行口蹄疫、羊痘、小反刍兽疫3种疫苗分点注射，15 d后O型口蹄疫抗体阳性率达到最高值，稍高于单苗注射组;上述3种病毒病疫苗和羊三联苗分点注射，结果病毒病疫苗免疫抗体检测结果基本一致。本试验结果显示口蹄疫苗免疫后15 d时对照组抗体水平达到较高水平，而试验A、B组在7 d时就达到了较高水平;试验组和单苗对照组在184 d时其抗体阳性率依然维持在86%以上的较高水平，显著高于其他人的试验结果，笔者认为多疫苗免疫对O型口蹄疫抗体产生具有促进和协同作用。
（2）徐雅萍等〔4〕对湖羊小反刍兽疫免疫效果的研究结果表明，90日龄以上湖羊免疫抗体合格率明显高于90日龄以下羊只，免疫后14 d左右可达到峰值，7个月后呈缓慢下降趋势。本试验开始前藏羊小反刍兽疫抗体阳性率达到100%，无法反映试验过程中试验组与对照组的差异，但可以说明成年藏羊每年注射1次小反刍兽疫苗，羊群抗体阳性率在1年内可以达到极高的水平，明显比注射1次疫苗的湖羊阳性率更高且持久。祁广仪等〔5〕研究结果显示，羊口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘分点注射组合和小反刍兽疫、羊痘、羊三联苗分点注射组合，小反刍兽疫抗体阳性率在30～45d达到最高值。笔者认为藏羊进行的多疫苗联合免疫，对小反刍兽疫抗体产生没有明显的干扰和抑制作用。
（3）试验组和对照组藏羊S2布鲁氏菌病疫苗注射1年后抗体平均阳性率分别维持在70%和60%，试验组注射疫苗后其布鲁氏菌病抗体阳性率在第15天时达到了峰值，154～184 d时抗体合格率依然处在100%的稳定状态，这比申捷等[6]的研究结论（经1次免疫后绵羊及山羊均在第20天时血清抗体阳性率达到最高峰，之后呈下降趋势，免疫后90 d降至14%以下）不同，其抗体水平稳定性强且维持时间更长。与李建玲等[7]的试验结果（S2疫苗免疫羊后14 d其血清抗体水平达到峰值，2次免疫的布鲁氏菌病抗体转阳率明显高于单次免疫）一致。
（4）吴婷等〔8〕研究认为湖羊羊痘疫苗免疫后第7天可产生较高水平的抗体，第28天左右达到峰值，第61天抗体水平合格率为85.7%。本试验中藏羊注射羊痘疫苗1年后抗体水平仍然较高，表明每年强化免疫可以维持较高抗体水平。姚菊霞等[3]认为，口蹄疫、羊三联、小反刍兽疫、羊痘同时分点免疫时羊痘抗体水平要优于单苗免疫组，本试验结果显示试验组和对照组藏羊羊痘免疫抗体均能达到较高水平，未发现明显的相互干扰和拮抗作用。
5 结论
O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病4种不同类型疫苗在成年藏羊中进行不同组合联合免疫，其安全性较好，没有发生明显的副反应，同时表现出了与单苗一致或稍好于单苗的免疫效果，抗体合格率达到或超过了国家规定的70%标准，相互干扰、拮抗作用不明显，在一定程度上还有协同促进作用，建议在海晏县今后的藏羊免疫预防中推广使用。
參考文献：
[1] 王 敏， 扈丽萍. 联合疫苗的发展与期望[J].中国自然医学杂志，2007， 9（5）：455-456.
[2] 陈 泳，殷红萍. 羊免疫口蹄疫疫苗后抗体消长规律的研究[J].中国畜禽种业，2012（5）：85-86.
[3] 姚菊霞，祁广仪，任宝玺，等. 羊四苗分点同时免疫与单苗免疫对比试验[J].畜牧兽医杂志，2016，35（3） ：44-47.
[4] 徐雅萍，邱寒峰，俞乾挺，等. 小反刍兽疫疫苗对不同日龄湖羊的免疫效果研究[J]. 中国预防兽医学报，2016，38（8）：646-648.
[5] 祁广仪，任宝玺，姚菊霞.羊一畜多苗多点同时联合注射效果研究[J].中兽医学杂志， 2015（6）：14-16.
[6] 申 捷，宝音达来，马立峰，等.布鲁氏菌病疫苗（S2株）免疫羊抗体消长规律的研究[J].中国动物检疫，2015（1）：68-73.
[7] 李建玲，李爱巧，杨启元，等.乌鲁木齐牛羊布鲁氏菌疫苗免疫效果对比试验 [J].中国动物检疫，2013（4）：47-49.
[8] 吴 婷，刘跃生，徐雅萍，等.湖羊羊痘疫苗免疫抗体消长规律[J].浙江农业科学，2017，30（4）：709-710.
关键词：藏羊;多疫苗联合免疫;单苗免疫
中图分类号：S858.26 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2021）07-0013-04
随着分子生物学、细胞生物学、医学生物技术等相关学科的飞速发展，新疫苗不断被研究和开发，疫苗种类大量增加。截至2005年底，我国已经生产使用的人用疫苗多达40余种。疫苗数量的增多，在预防多种传染病的同时，也伴随着一系列问题的产生，如儿童预防接种次数增加、疫苗管理难度加大、预防接种工作成本增高等。因此，开发并推广应用一剂可以预防多病的联合疫苗势在必行[1]。在家畜疫病防控方面，也面临同样问题，做到一剂可以预防多病的联合疫苗开发较少，目前常见的有羊四联疫苗、羊痘-小反刍兽疫苗等极少数疫苗。
随着羊肉价格的提高，海晏县高原型藏羊（以下统称藏羊）养殖发展迅速，流通日益频繁，导致藏羊疫病日趋复杂化，疫病防控难度增大。统计表明，海晏县藏羊每年注射病毒类、细菌类及寄生虫类疫苗近10种，需要抓羊进行预防注射及驱虫次数在12次以上，虽然通过注射栏建设等能够缓解免疫注射过程中的部分劳动力不足等问题，但依然存在农牧民防疫过程中抓羊负担重、基层防疫员免疫工作任务多等问题，增加了养殖成本，降低了经济效益。为探讨藏羊免疫新方法，创新免疫程序，降低免疫成本，减少应激反应，提高经济效益，对O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病等4种青海省强制性免疫疫苗的联合免疫与单苗免疫进行了对比试验，以期为多疫苗联合免疫和兽用联合疫苗的开发研究提供相关理论依据。
1 试验区基本情况
96351牧场位于海晏县东部，草原面积4万hm2，属高寒草甸草场。全场年存栏藏羊4.8万只，年产羔羊3万余只。根据地理布局牧场分为3个牧业生产大队，属集体管理体制。藏羊饲养采取放牧为主，冬春季节适量补饲玉米（按每只0.2 kg/d补饲），不同年龄、性别单独组群，统一生产、统一疫病预防的饲养管理方法。
2 材料与方法
2.1 试验时间与材料
2.1.1 试验时间及地点 2019年9月至2020年3月在96351部队牧场三大队进行。
2.1.2 供试藏羊 牧场三大队一牧户6岁经产母羊群，饲养数量550余只。选择有角、大小基本一致、膘情较好、临床检查健康母羊120只，在耳根皮下埋入电子耳标，同时在羊角涂抹油漆加以区分不同分组。
2.1.3 供试疫苗 中农威特生物科技股份有限公司生产的口蹄疫O型灭活疫苗，生产批号F190706J;新疆天康生物股份有限公司生产的小反刍兽疫活疫苗，生产批号2018037-2;青海生物药品有限公司生产的羊痘活疫苗，生產批号201822;乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂生产的布鲁氏菌活疫苗（S2株），生产批号190101。
2.1.4 检测试剂盒 O型口蹄疫液相阻断ELIAS抗体检测试剂盒、小反刍兽疫竞争ELIAS检测试剂盒、羊痘间接ELIAS抗原检测试剂盒均购自中国农业科学院兰州兽医研究所、批号分别为20200602133（10126）、20200527118、2020090419-1。布鲁氏菌竞争ELIAS抗体检测试剂盒，由广州悦洋生物技术有限公司生产，批号EB0220006，均在有效期内。
2.2 试验方法
2.2.1 试验分组 试验组分为A、B两组，每组藏羊30只，共60只。其中，A组同时在颈部、臀部和尾根皮内注射口蹄疫、小反刍兽疫及羊痘3种疫苗，B组同时在两侧颈部、臀部皮内注射口蹄疫、小反刍兽疫及布鲁氏菌病3种疫苗;对照组藏羊共60只，随机分4个小组，每组15只，分别注射口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病疫苗。
2.2.2 疫苗注射 每个组合3种疫苗由3人负责注射，分别在两侧颈部、臀部或尾根皮内进行注射，剂量按照说明书要求足量注射;注射部位进行剪毛、消毒处理，注射针头做到一畜一针。
2.2.3 免疫副反应观察 注苗后安排专人观察试验藏羊精神、采食、运动等状况，连续观察7 d。
2.2.4 采血及血清分离 所有羊只第1个月分别采集注射疫苗前和注射疫苗后7、14、21、28 d的颈静脉血液，从第2个月开始每月采血1次，连续采集6个月，每次采集血液量不少于5 mL，血清分离后在 -20 ℃冰箱保存待检。
2.2.5 实验室检测 对O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘、布鲁氏菌均采用ELIAS方法进行血清抗体水平检测。根据ELIAS检测试剂盒说明书进行检测，对检测数据进行详细记录并统计分析。
3 结果与分析
3.1 免疫副反应观察
供试羊注射疫苗1 d后临床抽检，注射部位稍有红肿，精神稍差，但均未出现明显的精神不振、饮食欲减退、行动缓慢或跛行等副反应，也未发现应激死亡羊只。
3.2 O型口蹄疫免疫抗体水平检测结果
由表1可见，A、B 两组口蹄疫抗体水平均在注射疫苗7 d后迅速而稳步上升，达到70%以上的阳性率，而对照组7 d后阳性率仅为57.14%。注射疫苗后，试验A、B 组抗体水平相较于对照组明显更高且稳定。
3.3 小反刍兽疫免疫抗体水平
试验藏羊在2019秋季防疫注射了小反刍疫苗，由表2可见，对照组和试验A、 B组小反刍兽疫抗体水平在注射疫苗前均处于100%高水平状态。注射疫苗后第184天时抗体水平仍处于稳定和持续的高水平状态。 3.4 布鲁氏菌病抗体水平
由表3可见，羊群藏羊在2018年秋季注射布鲁氏菌病S2号疫苗后，到次年秋季仍然达到了60%以上的抗体阳性率。试验组藏羊注射疫苗后在第7天时抗体阳性率已达100%，对照组在第15天时阳性率达到100%。2个组第184天时抗体阳性率依然维持在极高的水平。
3.5 羊痘免疫抗体水平
该牧户羊群在2018年秋季防疫期间进行了羊痘疫苗的免疫接种，从表4可以看出，试验羊在免疫前羊痘的抗体水平处于较高水平，注射疫苗后一直维持较高的抗体阳性率。
4 小结与讨论
（1）陈泳等〔2〕用正向间接血凝法对新疆绵羊进行了O型口蹄疫苗抗体消长情况研究，结果显示免疫后30 d抗体阳性率达到98.6%，150 d后降到73%。姚菊霞等〔3〕研究表明，绵羊进行口蹄疫、羊痘、小反刍兽疫3种疫苗分点注射，15 d后O型口蹄疫抗体阳性率达到最高值，稍高于单苗注射组;上述3种病毒病疫苗和羊三联苗分点注射，结果病毒病疫苗免疫抗体检测结果基本一致。本试验结果显示口蹄疫苗免疫后15 d时对照组抗体水平达到较高水平，而试验A、B组在7 d时就达到了较高水平;试验组和单苗对照组在184 d时其抗体阳性率依然维持在86%以上的较高水平，显著高于其他人的试验结果，笔者认为多疫苗免疫对O型口蹄疫抗体产生具有促进和协同作用。
（2）徐雅萍等〔4〕对湖羊小反刍兽疫免疫效果的研究结果表明，90日龄以上湖羊免疫抗体合格率明显高于90日龄以下羊只，免疫后14 d左右可达到峰值，7个月后呈缓慢下降趋势。本试验开始前藏羊小反刍兽疫抗体阳性率达到100%，无法反映试验过程中试验组与对照组的差异，但可以说明成年藏羊每年注射1次小反刍兽疫苗，羊群抗体阳性率在1年内可以达到极高的水平，明显比注射1次疫苗的湖羊阳性率更高且持久。祁广仪等〔5〕研究结果显示，羊口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘分点注射组合和小反刍兽疫、羊痘、羊三联苗分点注射组合，小反刍兽疫抗体阳性率在30～45d达到最高值。笔者认为藏羊进行的多疫苗联合免疫，对小反刍兽疫抗体产生没有明显的干扰和抑制作用。
（3）试验组和对照组藏羊S2布鲁氏菌病疫苗注射1年后抗体平均阳性率分别维持在70%和60%，试验组注射疫苗后其布鲁氏菌病抗体阳性率在第15天时达到了峰值，154～184 d时抗体合格率依然处在100%的稳定状态，这比申捷等[6]的研究结论（经1次免疫后绵羊及山羊均在第20天时血清抗体阳性率达到最高峰，之后呈下降趋势，免疫后90 d降至14%以下）不同，其抗体水平稳定性强且维持时间更长。与李建玲等[7]的试验结果（S2疫苗免疫羊后14 d其血清抗体水平达到峰值，2次免疫的布鲁氏菌病抗体转阳率明显高于单次免疫）一致。
（4）吴婷等〔8〕研究认为湖羊羊痘疫苗免疫后第7天可产生较高水平的抗体，第28天左右达到峰值，第61天抗体水平合格率为85.7%。本试验中藏羊注射羊痘疫苗1年后抗体水平仍然较高，表明每年强化免疫可以维持较高抗体水平。姚菊霞等[3]认为，口蹄疫、羊三联、小反刍兽疫、羊痘同时分点免疫时羊痘抗体水平要优于单苗免疫组，本试验结果显示试验组和对照组藏羊羊痘免疫抗体均能达到较高水平，未发现明显的相互干扰和拮抗作用。
5 结论
O型口蹄疫、小反刍兽疫、羊痘及布鲁氏菌病4种不同类型疫苗在成年藏羊中进行不同组合联合免疫，其安全性较好，没有发生明显的副反应，同时表现出了与单苗一致或稍好于单苗的免疫效果，抗体合格率达到或超过了国家规定的70%标准，相互干扰、拮抗作用不明显，在一定程度上还有协同促进作用，建议在海晏县今后的藏羊免疫预防中推广使用。
參考文献：
[1] 王 敏， 扈丽萍. 联合疫苗的发展与期望[J].中国自然医学杂志，2007， 9（5）：455-456.
[2] 陈 泳，殷红萍. 羊免疫口蹄疫疫苗后抗体消长规律的研究[J].中国畜禽种业，2012（5）：85-86.
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[5] 祁广仪，任宝玺，姚菊霞.羊一畜多苗多点同时联合注射效果研究[J].中兽医学杂志， 2015（6）：14-16.
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[7] 李建玲，李爱巧，杨启元，等.乌鲁木齐牛羊布鲁氏菌疫苗免疫效果对比试验 [J].中国动物检疫，2013（4）：47-49.
[8] 吴 婷，刘跃生，徐雅萍，等.湖羊羊痘疫苗免疫抗体消长规律[J].浙江农业科学，2017，30（4）：709-710.