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摘要为了解趋化性细胞逆趋化剂浓度梯度迁移的机理，用带有荧光标记的趋化剂(FITC-LPS)诱导了培养的中性粒细胞。发现中性粒细胞在靠近趋化剂的一侧的荧光比背离趋化剂一侧的荧光强，并朝趋化剂方向长出伪足移动。细胞在迎、背趋化剂两面与趋化剂结合浓度的差异导致细胞微丝组装的部位差异可能是造成伪足生长密度差异的原因，这一差异决定了细胞趋化运动的方向。
关键词 中性粒细胞；趋化剂；伪足
中图分类号 Q813.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2009)01-0268-01
趋化性是细胞朝可溶性化学刺激物移动的一种现象。一些真核细胞，如白细胞、神经胶质细胞、内皮细胞、骨髓细胞、肝癌细胞、平滑肌细胞等在体内均有明显的趋化现象，趋化运动时细胞可在体表任何部位形成临时性的细胞质突起(伪足) 作为运动器而移动[1，2]。
1.3抽提小鼠中性粒細胞与电镜观察
取5月龄小鼠，腹腔注射PVP-泛影葡胺溶液2mL后放回笼中过夜，诱导生成中性粒细胞。向小鼠腹腔注射0.5 mL水合氯醛麻醉后，剪开腹部表皮(注意不要弄破腹腔膜)，吸取腹水，在超净台加入Hanks液，2 000rpm离心5min，弃上清液得中性粒细胞。用2.5％戊二醛将中性粒细胞混匀，固定10h，用蒸馏水清洗后滴在样品台上自然干燥，然后镀金，放在扫描电镜下观察。
1.4细胞培养及细胞趋化
1.4.1平板打孔趋化试验。在培养皿中倒上培养基，待冷却后在中间打一孔加LPS，间距8mm打四周孔，孔内加培养的中性粒细胞。然后置细胞培养箱中 5％ CO2 培养5h。最后在倒置显微镜下观察中性粒细胞向中心孔移动情况。
1.4.2用荧光剂FITC标记LPS。将4mg LPS加入0.5％三乙胺2mL内，0℃搅拌20min，使LPS双链离解为单链结构。用1moL/L的盐酸10μL将其pH值调为5，然后加入含5mg FITC的0.1moL/L磷酸钠溶液1.5mL(pH值9.5)，并在37 ℃下搅拌孵育3h，孵育后，在4℃下将其混合物与磷酸钠溶液彻底离心后，去上清液即得带FITC荧光标记的LPS。
1.4.3荧光显微镜下观察中性粒细胞与趋化剂不均匀的结合。在载玻片上先滴加几滴1640培养液，加入中性粒细胞。试验组的玻片一端加入50μL的荧光标记的LPS趋化剂，置CO2 培养箱培养，5h后用滤纸小心沿玻片上的液体吸干，用细胞培养液小心清洗几次，切勿将细胞漂起扰动极性。清洗完毕，吸去玻片上的残液，置荧光显微镜下用绿色滤光片观察。
2结果与分析
在显微镜下，对照组的中性粒细胞呈圆形；用无荧光标记的趋化剂处理的中性粒细胞呈不规则形状，有一端有类似片足的结构。FITC-LPS趋化的中性粒细胞在荧光显微镜下可看到大部分细胞迎趋化剂一端荧光较亮并有较多突起，背趋化剂一端较暗并较圆滑(见图1、图2)。
3讨论
趋化剂与细胞表面的受体结合引起F-actin组装的信号通路激活，最后通过质膜部位的WASP蛋白激活Arp2/3复合物，导致肌动蛋白的聚合。本试验揭示了细胞逆趋化剂浓度梯度迁移的初步机理。即趋化剂在扩散空间形成的浓度差异，使细胞不同部位的表面结合趋化剂数量有差异，在细胞迎趋化剂面结合的趋化剂比背面多，诱导F-actin组装的信号物质激活较多，导致细胞在趋化剂一面F-actin的聚合比背离趋化剂那面多，结果使细胞在靠近趋化剂一面伸出形成大量含微丝的伪足，Myosin-Ⅱ(肌球蛋白)介导的收缩引起细胞尾部收缩，两方面的作用和变化最终导致了细胞逆趋化剂方向产生方向性运动[6，7]。
运用FITC荧光材料标记趋化剂LPS，不仅保留了LPS的活性，同时使LPS带有荧光，用它诱导培养的中性粒细胞趋化性移动，可通过观察细胞不同部位的荧光强度，从而判断中性粒细胞与趋化剂结合的方位与细胞移动方向的关系。
4参考文献
[1] 张秀真，吴泽志.细胞伪足形成与微丝骨架研究进展[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，2005，26(4)：213-216.
[2] 朱大年.生理学(第七版)[M].北京：人民卫生出版社，2008.
[3] 严尉峰.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2001.
[4] 周正任.医学微生物学(第六版)[M].北京：人民卫生出版社，2007.
[5] 李燕，牟伯中.细菌趋化性研究进展[J].应用与环境生物学报，2006， 12(1)：135-139.
[6] 翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学(第三版)[M].北京：高等教育出版社，2007.
[7] 袁春华.fMLP诱导中性粒细胞极性及其机制研究[D].广州：南方医科大学，2007.
[8] 李鹏，邢杰.中性粒细胞的分离与纯化[J].医学理论与实践，2005，18(3)：272-274.
关键词 中性粒细胞；趋化剂；伪足
中图分类号 Q813.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2009)01-0268-01
趋化性是细胞朝可溶性化学刺激物移动的一种现象。一些真核细胞，如白细胞、神经胶质细胞、内皮细胞、骨髓细胞、肝癌细胞、平滑肌细胞等在体内均有明显的趋化现象，趋化运动时细胞可在体表任何部位形成临时性的细胞质突起(伪足) 作为运动器而移动[1，2]。
1.3抽提小鼠中性粒細胞与电镜观察
取5月龄小鼠，腹腔注射PVP-泛影葡胺溶液2mL后放回笼中过夜，诱导生成中性粒细胞。向小鼠腹腔注射0.5 mL水合氯醛麻醉后，剪开腹部表皮(注意不要弄破腹腔膜)，吸取腹水，在超净台加入Hanks液，2 000rpm离心5min，弃上清液得中性粒细胞。用2.5％戊二醛将中性粒细胞混匀，固定10h，用蒸馏水清洗后滴在样品台上自然干燥，然后镀金，放在扫描电镜下观察。
1.4细胞培养及细胞趋化
1.4.1平板打孔趋化试验。在培养皿中倒上培养基，待冷却后在中间打一孔加LPS，间距8mm打四周孔，孔内加培养的中性粒细胞。然后置细胞培养箱中 5％ CO2 培养5h。最后在倒置显微镜下观察中性粒细胞向中心孔移动情况。
1.4.2用荧光剂FITC标记LPS。将4mg LPS加入0.5％三乙胺2mL内，0℃搅拌20min，使LPS双链离解为单链结构。用1moL/L的盐酸10μL将其pH值调为5，然后加入含5mg FITC的0.1moL/L磷酸钠溶液1.5mL(pH值9.5)，并在37 ℃下搅拌孵育3h，孵育后，在4℃下将其混合物与磷酸钠溶液彻底离心后，去上清液即得带FITC荧光标记的LPS。
1.4.3荧光显微镜下观察中性粒细胞与趋化剂不均匀的结合。在载玻片上先滴加几滴1640培养液，加入中性粒细胞。试验组的玻片一端加入50μL的荧光标记的LPS趋化剂，置CO2 培养箱培养，5h后用滤纸小心沿玻片上的液体吸干，用细胞培养液小心清洗几次，切勿将细胞漂起扰动极性。清洗完毕，吸去玻片上的残液，置荧光显微镜下用绿色滤光片观察。
2结果与分析
在显微镜下，对照组的中性粒细胞呈圆形；用无荧光标记的趋化剂处理的中性粒细胞呈不规则形状，有一端有类似片足的结构。FITC-LPS趋化的中性粒细胞在荧光显微镜下可看到大部分细胞迎趋化剂一端荧光较亮并有较多突起，背趋化剂一端较暗并较圆滑(见图1、图2)。
3讨论
趋化剂与细胞表面的受体结合引起F-actin组装的信号通路激活，最后通过质膜部位的WASP蛋白激活Arp2/3复合物，导致肌动蛋白的聚合。本试验揭示了细胞逆趋化剂浓度梯度迁移的初步机理。即趋化剂在扩散空间形成的浓度差异，使细胞不同部位的表面结合趋化剂数量有差异，在细胞迎趋化剂面结合的趋化剂比背面多，诱导F-actin组装的信号物质激活较多，导致细胞在趋化剂一面F-actin的聚合比背离趋化剂那面多，结果使细胞在靠近趋化剂一面伸出形成大量含微丝的伪足，Myosin-Ⅱ(肌球蛋白)介导的收缩引起细胞尾部收缩，两方面的作用和变化最终导致了细胞逆趋化剂方向产生方向性运动[6，7]。
运用FITC荧光材料标记趋化剂LPS，不仅保留了LPS的活性，同时使LPS带有荧光，用它诱导培养的中性粒细胞趋化性移动，可通过观察细胞不同部位的荧光强度，从而判断中性粒细胞与趋化剂结合的方位与细胞移动方向的关系。
4参考文献
[1] 张秀真，吴泽志.细胞伪足形成与微丝骨架研究进展[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册)，2005，26(4)：213-216.
[2] 朱大年.生理学(第七版)[M].北京：人民卫生出版社，2008.
[3] 严尉峰.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2001.
[4] 周正任.医学微生物学(第六版)[M].北京：人民卫生出版社，2007.
[5] 李燕，牟伯中.细菌趋化性研究进展[J].应用与环境生物学报，2006， 12(1)：135-139.
[6] 翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学(第三版)[M].北京：高等教育出版社，2007.
[7] 袁春华.fMLP诱导中性粒细胞极性及其机制研究[D].广州：南方医科大学，2007.
[8] 李鹏，邢杰.中性粒细胞的分离与纯化[J].医学理论与实践，2005，18(3)：272-274.