【摘 要】
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去泛素化酶是泛素化途径的逆调节酶,参与调控蛋白质的降解.为了探索小麦(Triticum aestivum)去泛素化酶家族成员WTG1 (wide and thick grain 1)基因的功能,本研究利用生物信
【机 构】
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西北农林科技大学生命科学学院,杨陵,712100西北农林科技大学生命科学学院,杨陵712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,杨凌712100;
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去泛素化酶是泛素化途径的逆调节酶,参与调控蛋白质的降解.为了探索小麦(Triticum aestivum)去泛素化酶家族成员WTG1 (wide and thick grain 1)基因的功能,本研究利用生物信息学方法对小麦TaWTG1编码蛋白的理化性质和结构进行了分析;进一步构建其原核表达载体pET28a-TaWTG1,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株BL21(DE3),对重组蛋白His-TaWTG1诱导表达条件(包括培养温度,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度和诱导时间)进行优化;进一步对重组蛋白进行可溶性分析和镍柱分离纯化,并对其去泛素化活性进行体外验证.结果 表明,TaWTG1蛋白由319个氨基酸组成,理论分子量为35.38 kD,等电点为4.62;其三级结构主要由α螺旋构成,含有OTU (ovarian tumor-related proteases)相关蛋白酶家族的otubain保守结构域;重组蛋白His-TaWTG1的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、28 q℃诱导6h;该重组蛋白主要以可溶形式存在于上清液中.Western blot分析确定用镍柱分离纯化获得的重组蛋白为目的蛋白;体外活性分析实验表明,TaWTG1具有去泛素化酶活性,可以切割赖氨酸(K)48和K63连接的四聚泛素链.本研究为TaWTG1基因功能研究提供了基础资料.
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