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摘 要：[目的] 建立青叶胆乙醇提取物中1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮的含量测定方法。[方法] 采用反相高效液相法对其主要成分1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮进行含量测定，测定条件为：色谱柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）不锈钢柱，流动相：乙腈-水（50：50）；流速：1ml/min，检测波长：254nm；[结果] 建立了高效液相法测定青叶胆乙醇提取物中1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮含量的方法，进样量在0.056-0.280μg之间，呈良好的线性关系，相关系数r=0.9999；
关键词：青叶胆 含量测定 1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮
青叶胆S.mileensisT.N.HoetW.I.Shi系龙胆科獐牙菜属植物，在民间属于该属中的青叶胆类，主要分布于我国云南，在云南哈尼族、彝族、及周边地区民间常用于治疗肝胆类疾病[1]。现代研究发现，从青叶胆中分离得到的齐墩果酸、环烯醚萜类成分、口山酮类成分具有保肝、抗炎的作用。其中环烯醚萜类成分含量最高，而近年来，随着对化学成分研究的深入，口山酮类成分的抗肝炎成为了青叶胆研究的热点，其中最主要的成分为1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮，其与齐墩果酸可发生协同作用，达到良好的抗肝炎效果。青叶胆中口山酮类成分较多存在于乙醇提取物中[2-3]。而对此成分的含量测定文献报道较少，因此本文对1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮进行了含量测定方法的研究。
1 试剂及仪器
1.1试剂
三批青叶胆乙醇提取物干粉（自制，80%乙醇回流提取），批号2016001、2016002、2016003，1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品（购自中国药品生物制品检定所，归一化法检查，含量為98%以上），甲醇为色谱纯（河北邢台化学试剂有限责任公司），磷酸为分析纯（河北邢台化学试剂有限责任公司），水为超纯净水。
1.2仪器
HP1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），G1314A型紫外检测器（安捷伦科技有限公司），C18色谱柱4.6×250mm，5μm（迪马科技有限公司）、BP211D型电子分析天平（南京创瑞科技仪器仪表有限公司）、SY型超声提取器（上海宁商超声仪器有限公司）
2 方法与结果
2.1 色谱条件的选择
色谱柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm），填料为十八烷基硅烷健合硅胶；流动相：乙腈-水（50：50）；检测波长：254nm； 流速：1ml/min；柱温：30℃。
2.2 样品的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品5.60mg，置200ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.0280mg/ml的对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取2011001批青叶胆乙醇提取物约30mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加入甲醇80ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，静置。精密吸取上清液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮供试品溶液。
2.3 流动相的吸收度，柱效及分离度
经过测试，流动相的吸收度为0.05，符合《中国药典》2015年版要求。
柱效测定：取对照品溶液适量，注入色谱仪，记录色谱图，计算1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮的理论板数。N=5.54×tR/W1/2=16523。
分离度：从样品图看1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮和杂质峰能达到基线分离，杂质峰对样品峰没有影响，见图2。
2.4 提取方法的考察
取2016001批青叶胆乙醇提取物，采用不同的提取溶剂进行提取， 进行含量测定，结果见表1。
试验结果表明不同提取方法均能将1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮提取完全，为简便操作，故选择甲醇超声提取。
2.5 提取时间的考察
取2016001批青叶胆乙醇提取物，采用不同时间甲醇超声提取，结果见表2。
试验结果表明采用甲醇超声提取30分钟，即可将提取物中的1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮提取完全。
2.6 方法学考察
2.6.1 对照品和样品的色谱图
分别取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮供试品溶液、对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1、2。
2.6.2 线性关系考察
分别吸取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制浓度为0.0056 mg/ml、0.0112 mg/ml、0.0168 mg/ml、0.0224 mg/ml、0.0280 mg/ml的对照品溶液，分别进样10μl，测得峰面积，结果见表3。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图绘制标准曲线，如图3，在进样量为0.056-0.280μg之间，呈良好的线性关系。标准曲线的回归方程为Y=5488.3X-24.539，相关系数r=0.9999。
2.6.3 精密度试验
取供试品溶液15ml置于25ml容量瓶中，连续进样5次，记录峰面积为880.976，892.564，890.146，899.489，894.856 ，平均峰面积X=891.606 ，计算 RSD（%）=0.77%，表明本方法精密度良好。
2.6.4 重现性试验
取2016001批青叶胆乙醇提取物，精密称取5份，按供试品制备法处理，进行测定，结果见表16。X=9.33% ，RSD（%）=0.87%，结果表明，测定方法的重现性良好，见表4。
2.6.5 稳定性试验
取2016001批青叶胆乙醇提取物，按供试品制备方法处理，得样品溶液，每隔2小时进样1次，结果见表5。X=9.46%，RSD（%）=1.46%，表明样品在16小时内稳定。
2.6.6 回收率试验
取已知含量的2016001批青叶胆乙醇提取物5份，各约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入浓度为0.0345mg/ml的对照品溶液，按法处理，各取10μl进样，结果见表6。结果平均回收率X=98.47%，RSD=0.95%。
2.6.7 样品测定
取三批青叶胆乙醇提取物干粉，取约30mg，按供试品制备方法处理，各取10μl进样，结果见表 7。
3 结论
青叶胆乙醇提取物的保肝利胆活性成分主要为总口山酮和齐墩果酸的有效部位。其总口山酮中又以1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮的保肝降酶作用最为关键，并与齐墩果酸之间存在协同关系，本文主要针对1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮进行了含量测定方法的研究。实验对提取时间及提取溶剂进行了考察，经过超声等处理后，干扰比较少，且稳定性和重复性好，在达到了含量测定的要求，是一种理想的1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮含量测定方法。
参考文献：
[1] 周荣汉，段金廒.植物化学分类学[M].上海科学技术出版社，2005：987-988.
[2] 何仁远，冯树基，聂瑞麟.青叶胆口山酮成分的分离和鉴定[J].云南植物研究，1982，4（1）：68，76.
[3] 刘嘉森，黄梅芬.青叶胆中雏菊叶龙胆酮成分的分离和鉴定[J].中草药，1982，13（10）：433-434.
作者简介：
王龙（1986-），男，河北内丘人，硕士，研究方向：中药学
关键词：青叶胆 含量测定 1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮
青叶胆S.mileensisT.N.HoetW.I.Shi系龙胆科獐牙菜属植物，在民间属于该属中的青叶胆类，主要分布于我国云南，在云南哈尼族、彝族、及周边地区民间常用于治疗肝胆类疾病[1]。现代研究发现，从青叶胆中分离得到的齐墩果酸、环烯醚萜类成分、口山酮类成分具有保肝、抗炎的作用。其中环烯醚萜类成分含量最高，而近年来，随着对化学成分研究的深入，口山酮类成分的抗肝炎成为了青叶胆研究的热点，其中最主要的成分为1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮，其与齐墩果酸可发生协同作用，达到良好的抗肝炎效果。青叶胆中口山酮类成分较多存在于乙醇提取物中[2-3]。而对此成分的含量测定文献报道较少，因此本文对1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮进行了含量测定方法的研究。
1 试剂及仪器
1.1试剂
三批青叶胆乙醇提取物干粉（自制，80%乙醇回流提取），批号2016001、2016002、2016003，1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品（购自中国药品生物制品检定所，归一化法检查，含量為98%以上），甲醇为色谱纯（河北邢台化学试剂有限责任公司），磷酸为分析纯（河北邢台化学试剂有限责任公司），水为超纯净水。
1.2仪器
HP1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），G1314A型紫外检测器（安捷伦科技有限公司），C18色谱柱4.6×250mm，5μm（迪马科技有限公司）、BP211D型电子分析天平（南京创瑞科技仪器仪表有限公司）、SY型超声提取器（上海宁商超声仪器有限公司）
2 方法与结果
2.1 色谱条件的选择
色谱柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm），填料为十八烷基硅烷健合硅胶；流动相：乙腈-水（50：50）；检测波长：254nm； 流速：1ml/min；柱温：30℃。
2.2 样品的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品5.60mg，置200ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.0280mg/ml的对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取2011001批青叶胆乙醇提取物约30mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加入甲醇80ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，静置。精密吸取上清液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得1，5，8-三羥基-3-甲氧基口山酮供试品溶液。
2.3 流动相的吸收度，柱效及分离度
经过测试，流动相的吸收度为0.05，符合《中国药典》2015年版要求。
柱效测定：取对照品溶液适量，注入色谱仪，记录色谱图，计算1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮的理论板数。N=5.54×tR/W1/2=16523。
分离度：从样品图看1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮和杂质峰能达到基线分离，杂质峰对样品峰没有影响，见图2。
2.4 提取方法的考察
取2016001批青叶胆乙醇提取物，采用不同的提取溶剂进行提取， 进行含量测定，结果见表1。
试验结果表明不同提取方法均能将1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮提取完全，为简便操作，故选择甲醇超声提取。
2.5 提取时间的考察
取2016001批青叶胆乙醇提取物，采用不同时间甲醇超声提取，结果见表2。
试验结果表明采用甲醇超声提取30分钟，即可将提取物中的1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山 酮提取完全。
2.6 方法学考察
2.6.1 对照品和样品的色谱图
分别取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮供试品溶液、对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1、2。
2.6.2 线性关系考察
分别吸取1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮对照品溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制浓度为0.0056 mg/ml、0.0112 mg/ml、0.0168 mg/ml、0.0224 mg/ml、0.0280 mg/ml的对照品溶液，分别进样10μl，测得峰面积，结果见表3。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图绘制标准曲线，如图3，在进样量为0.056-0.280μg之间，呈良好的线性关系。标准曲线的回归方程为Y=5488.3X-24.539，相关系数r=0.9999。
2.6.3 精密度试验
取供试品溶液15ml置于25ml容量瓶中，连续进样5次，记录峰面积为880.976，892.564，890.146，899.489，894.856 ，平均峰面积X=891.606 ，计算 RSD（%）=0.77%，表明本方法精密度良好。
2.6.4 重现性试验
取2016001批青叶胆乙醇提取物，精密称取5份，按供试品制备法处理，进行测定，结果见表16。X=9.33% ，RSD（%）=0.87%，结果表明，测定方法的重现性良好，见表4。
2.6.5 稳定性试验
取2016001批青叶胆乙醇提取物，按供试品制备方法处理，得样品溶液，每隔2小时进样1次，结果见表5。X=9.46%，RSD（%）=1.46%，表明样品在16小时内稳定。
2.6.6 回收率试验
取已知含量的2016001批青叶胆乙醇提取物5份，各约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入浓度为0.0345mg/ml的对照品溶液，按法处理，各取10μl进样，结果见表6。结果平均回收率X=98.47%，RSD=0.95%。
2.6.7 样品测定
取三批青叶胆乙醇提取物干粉，取约30mg，按供试品制备方法处理，各取10μl进样，结果见表 7。
3 结论
青叶胆乙醇提取物的保肝利胆活性成分主要为总口山酮和齐墩果酸的有效部位。其总口山酮中又以1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮的保肝降酶作用最为关键，并与齐墩果酸之间存在协同关系，本文主要针对1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮进行了含量测定方法的研究。实验对提取时间及提取溶剂进行了考察，经过超声等处理后，干扰比较少，且稳定性和重复性好，在达到了含量测定的要求，是一种理想的1，5，8-三羟基-3-甲氧基口山酮含量测定方法。
参考文献：
[1] 周荣汉，段金廒.植物化学分类学[M].上海科学技术出版社，2005：987-988.
[2] 何仁远，冯树基，聂瑞麟.青叶胆口山酮成分的分离和鉴定[J].云南植物研究，1982，4（1）：68，76.
[3] 刘嘉森，黄梅芬.青叶胆中雏菊叶龙胆酮成分的分离和鉴定[J].中草药，1982，13（10）：433-434.
作者简介：
王龙（1986-），男，河北内丘人，硕士，研究方向：中药学