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【摘要】目的:比较冰冻血小板和新鲜血小板输注后血液的促凝功能。方法:该课题以100名志愿患者为研究对象,抽取其新鲜血液2ml后,随机输注50份冰冻血小板和50份新鲜血小板悬液,24小时后重新采血。分别经酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测冰冻血小板和新鲜血小板输注前后的β-血小板球蛋白(β thromboglobulin,β-TG)、血小板α-颗粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140,GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)。采用Born氏比浊法检测冰冻血小板和新鲜血小板输注前后的聚集率,所用诱导剂的终浓度为花生四烯酸(arachidonic acid,AA)782.0 µmol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)47.6µmol/L和胶原(collagen)4.8mg/L。结果:冰冻血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4分别为(51.5±4.4)ng/ml、(32.1±6.8)ng/ml和(25.5±4.9)ng/ml,新鲜血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4分别为(40.3±4.0)ng/ml、(24.3±4.8)ng/ml和(18.8±3.6)ng/ml,冰冻血小板释放的β-TG、GMP-140和PF4均高于新鲜血小板(P<0.05)。在AA、ADP和胶原的诱导下,冰冻血小板的聚集率分别为(81.15±6.39)%、(83.04±6.09)%和(81.25±8.28)%,新鲜血小板的聚集率分别为(76.11±5.77)%、(76.59±5.30)%和(72.40±6.94)%,冰冻血小板对AA、ADP和胶原的聚集率均高于新鲜血小板(P<0.05～0.01)。结论:冰冻血小板的促凝血功能强于新鲜血小板,在血源日趋紧张的今天,可以大量长期储备冰冻血小板,以满足临床应用血小板的需求。
【关键词】冰冻血小板;新鲜血小板;促凝功能
【中图分类号】R-33【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-028-2
机采新鲜浓缩血小板,简称新鲜血小板。目前临床上广泛应用机采新鲜血小板输注治疗血小板减少性疾病,但由于机采新鲜浓缩血小板的来源有限,满足不了临床的需求,便应用冰冻新鲜血小板的临床输注[1]。冰冻血小板虽然具有保存期长、无污染危险、使用方便、随用随取以及有利于出血性危重患者的及时抢救治疗等优点[2],但其促凝功能与新鲜血小板不同。β-血小板球蛋白(β thromboglobulin,β-TG)、血小板α-颗粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140,GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是血小板特异性球蛋白,在血小板活化时由血小板内的α颗粒释放[3,4],测定β-TG、GMP-140和PF4的含量可反映血小板的促凝功能。本文比较了冰冻血小板和新鲜血小板的输注后机体促凝功能变化。
1材料与方法
1.1血小板制品
冰冻血小板和机采新鲜血小板均来自汕头市中心血站。新鲜血小板使用MCS+血细胞分离机(美国血液技术公司)采集,供者均符合《卫生部献血者健康检查标准》,机器连续采集献血者全血3000～4000ml,获得浓缩血小板悬液终体积220～250ml为1个治疗量,其血小板数值>215×1011,于当日采集后3h内输注,输注量为1个治疗量。采集出的新鲜血小板在无菌条件下注入浓度为4%～6%的二甲基亚砜,置于-8°C以下冰箱内保存即为冰冻血小板,保存期为半年。
1.2血小板输注
随机选择100名志愿输注新鲜血小板或冰冻血小板患者,输注前分别先抽取新鲜血液2ml。分别取50份冰冻血小板和50份新鲜血小板悬液,每份20单位。冰冻血小板输注前置42°C恒温箱解冻,經生理盐水洗涤。采用随机输注方法,输注24小时后再分别抽取新鲜血液2ml。
1.3β-TG、GMP-140和PF4检测
将输注前后分别抽取的新鲜血液,3000×g离心20min,取上清液,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosor
-bent assay,ELISA)检测β-TG、GMP-140和PF4。试剂采用罗氏公司(Roche Diagnostics)的ELISA试剂盒,变异度分析控制在15%以内。
1.4血小板聚集功能
采用Born氏比浊法[5]检测输注前后血小板的聚集率,所用诱导剂的终浓度为花生四烯酸(arachidonic acid,AA)782.0µmol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)47.6µmol/L和胶原(collagen)4.8mg/L。
1.5统计学分析
数据按公式“促凝功能变化=输注后促凝功能-输注前促凝功能”,以x±s表示,采用SPSS软件包进行完全随机化设计资料的方差分析。
2结果
2.1输注前后冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
图1 冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
ELISA检测显示,输注冰冻血小板后β-TG为51.5±4.4ng/ml,输注新鲜血小板β-TG为40.3±4.0ng/ml,输注冰冻血小板后释放的β-TG高于新鲜血小板(P<0.05)(见图1)。
2.2输注前后冰冻血小板和新鲜血小板GMP-140的表达情况
ELISA检测结果表明,输注冰冻血小板后GMP-140为32.1±6.8ng/ml,输注新鲜血小板后机体GMP-140为24.3±4.8ng/ml,输注冰冻血小板后GMP-140高于新鲜血小板(P<0.05)(见图2)。
图2 冰冻血小板和新鲜血小板GMP-140的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
2.3输注前后冰冻血小板和新鲜血小板PF4的表达情况
ELISA检测结果表明,输注冰冻血小板后PF4为25.5±4.9ng/ml,输注新鲜血小板后PF4为18.8±3.6ng/ml,输注冰冻血小板后PF4高于新鲜血小板(P<0.05)(见图3)。
图3 冰冻血小板和新鲜血小板PF4的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
2.4输注冰冻血小板和新鲜血小板后机体的聚集功能
在AA、ADP和胶原的诱导下,冰冻血小板的聚集率均高于新鲜血小板(P<0.05～0.01)(见表1)。
表1 冰冻血小板和新鲜血小板的聚集率(%)
组别 诱聚剂
AA ADP 胶原
冰冻血小板
新鲜血小板 81.15±6.39
76.11±5.77* 83.04±6.09
76.59±5.30* 81.25±8.28
72.40±6.94**
注:*:与冰冻血小板相比,与P<0.05;**:与冰冻血小板相比,与P<0.01。
3讨论
血小板的功能包括粘附、聚集和促凝等方面,从广义上讲,血小板的粘附和聚集也属于促凝功能[6]。临床上,无论是静脉出血还是动脉出血,输注血小板的目的都是为了尽快止血,因而血小板的促凝功能是最关键的。
β-TG是血小板α颗粒合成的特异性蛋白,由四条肽链组成,通过抑制血管内皮细胞生成前列环素(prostacyclin,
PGI2)而发挥促凝作用[7]。由于β-TG主要存在于血小板中,因此测定血小板释放的β-TG已成为反映血小板促凝功能的一项指标。GMP-140是血小板激活脱颗粒反应中α颗粒释放的遗留产物,在血小板被激活时被释放出来,可促进细胞之间的连接,具有介导活性血小板与内皮细胞相互作用的功能,在凝血过程中起重要作用。因而GMP-140也是反映血小板促凝活性的分子标志物之一[8]。PF4是血小板α颗粒中的另外一种活性因子,为四聚体糖蛋白,由相同的70个氨基酸单体以共价键结合,单体的相对分子质量为7800。每个单体的N末端具有可变区,单体通过此区以两个二硫键锚定在PF4蛋白质核心上,此区由3个非平行β折叠和一个α螺旋结构组成[9]。PF4在血小板粘附、聚集、活化时以蛋白多糖复合物的形式从血小板中释放,能降低内皮细胞表面硫酸乙酰肝素的抗凝作用,并使血小板聚集,促进血液在血管内皮细胞表面凝固,因此PF4也是反映血小板促凝反应的标记物[10]。我们的研究结果表明,机体输注冰冻血小板后释放β-TG、GMP-140和PF4多于输注新鲜血小板,说明输注冰冻血小板后机体的促凝功能强于输注新鲜血小板。
我们在实验中还发现,在AA、ADP和胶原分别作为诱聚剂的情况下,输注冰冻血小板后的血液聚集率均高于输注新鲜血小板后。血小板聚集是血小板的主要功能之一,在止、凝血过程中,血小板聚集起着关键的作用[11]。因此,血小板聚集功能在一定程度上反映了血小板的促凝活性。此外,Owens[12]等报道患者输注新鲜血小板后,血小板的粘附能力只有输注冰冻血小板的53%,提示冰冻血小板的粘附功能也强于新鲜血小板。冰冻血小板的粘附能力和促凝活性增强可能与冰冻后血小板对于凝血因子V的结合能力增强有关。刘景汉[13]等通过观察大量血小板输注的临床病例,发现冰冻机采血小板的止血效果优于常规保存液体血小板,尤其是冰冻血小板输注取得了满意疗效。在该试验中,我们发现输注冰冻血小板后机体的促凝功能明显优于输注新鲜血小板后。我们在临床工作中也发现,冰冻血小板输血反应的发生率低于新鲜血小板,而且取得了较为满意的效果。滕本秀等[14]则通过临床实践,证实了冰冻新鲜血小板除了具有新鲜血小板的优点外,还具有保存期长,无污染危险,使用方便,随用随取等优点,因而更有利于危重出血患者的抢救治疗。但输注冰冻血小板之后,血小板计数的增加不及输注新鲜血小板后明显[15]。
综上所述,冰冻血小板的促凝血功能强于新鲜血小板,并且有充足的时间进行病毒检测,减少了传染性疾病传播的风险。虽然冰冻血小板在提升血小板计数方面不及新鲜血小板,但是在血源日趋紧张的今天,经深低温保存的冰冻血小板在安全性和止血效果方面均尤于新鲜血小板,可以大量长期储备,以满足临床应用血小板的需求。
参考文献
[1] 陈静,刘世鹏.单采冰冻血小板输注在创伤性大失血中的应用[J].河北医药,2009,31(22):3117-3118.
[2] 杨世明,张勇萍,田榆,等.单采冰冻血小板临床应用疗效的分析[J]第四军医大学学报,2009,30(21):2438-3440.
[3] Ohkawa R,Hirowatari Y,Nakamura K,et al.Platelet release of beta-thromboglobulin and platelet factor 4 and serotonin in plasma samples.Clin Biochem,2005,38(11):1023-1026.
[4] 楊美荣,陈乃耀.血小板α-颗粒膜蛋白与血栓性疾病的相关关系[J].华北煤炭医学院学报,2007,9(2):189-190.
[5] Born GV.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.Nature.1962 Jun 9;194:927.
[6] Polasek J.Procoagulant potential of platelet alpha granules.Platelets.2004,15(7):403-407.
[7] Lawler JW.Prediction of the secondary structure of platelet factor 4 and beta-thromboglobulin from their amino acid sequences.Thromb Res.1981,21(1-2):121-127.
[8] Undar L,Akkoç N,Alakavuklar MN,et al.Flow cytometric analysis of circadian changes in platelet activation using anti-GMP-140 monoclonal antibody.Chronobiol Int.1999,16(3):335-342.
[9] El Golli N,Issertial O,Rosa JP,et al.Evidence for a granule targeting sequence within platelet factor 4.J Biol Chem.2005,280(34):30329-30335.
[10] Thachil J.The prothrombotic potential of platelet factor 4.Eur J Intern Med.2010,21(2):79-83.
[11] Saxena R,Mohanty S,Choudhry VP.Platelet contribution to blood coagulation in patients with markedly reduced platelet aggregation.Thromb Res.1999,95(2):135-136.
[12] Owens M.Cryopreserved platelets have decrease adhesive capacity.Tansfusion,1991,31(2):160-165.
[13] 刘景汉,于洋,欧阳锡林,李锡.深低温保存血小板临床应用疗效评价[J].中华内科杂志,2004,6(8):1046-1049.
[14] 滕本秀,段惠玲,段前碧,等.新鲜血小板与新鲜冰冻血小板的临床应用[J].中华中西医杂志,2004,10(5):19-21.
[15] 赖建芬,卢少芬,李彩莲.输注新鲜血小板与冰冻血小板的临床效果对照[J].国际医药卫生导报,2006,12(3):32-34.
【关键词】冰冻血小板;新鲜血小板;促凝功能
【中图分类号】R-33【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-028-2
机采新鲜浓缩血小板,简称新鲜血小板。目前临床上广泛应用机采新鲜血小板输注治疗血小板减少性疾病,但由于机采新鲜浓缩血小板的来源有限,满足不了临床的需求,便应用冰冻新鲜血小板的临床输注[1]。冰冻血小板虽然具有保存期长、无污染危险、使用方便、随用随取以及有利于出血性危重患者的及时抢救治疗等优点[2],但其促凝功能与新鲜血小板不同。β-血小板球蛋白(β thromboglobulin,β-TG)、血小板α-颗粒膜蛋白-140(granule membrane protein 140,GMP-140)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是血小板特异性球蛋白,在血小板活化时由血小板内的α颗粒释放[3,4],测定β-TG、GMP-140和PF4的含量可反映血小板的促凝功能。本文比较了冰冻血小板和新鲜血小板的输注后机体促凝功能变化。
1材料与方法
1.1血小板制品
冰冻血小板和机采新鲜血小板均来自汕头市中心血站。新鲜血小板使用MCS+血细胞分离机(美国血液技术公司)采集,供者均符合《卫生部献血者健康检查标准》,机器连续采集献血者全血3000～4000ml,获得浓缩血小板悬液终体积220～250ml为1个治疗量,其血小板数值>215×1011,于当日采集后3h内输注,输注量为1个治疗量。采集出的新鲜血小板在无菌条件下注入浓度为4%～6%的二甲基亚砜,置于-8°C以下冰箱内保存即为冰冻血小板,保存期为半年。
1.2血小板输注
随机选择100名志愿输注新鲜血小板或冰冻血小板患者,输注前分别先抽取新鲜血液2ml。分别取50份冰冻血小板和50份新鲜血小板悬液,每份20单位。冰冻血小板输注前置42°C恒温箱解冻,經生理盐水洗涤。采用随机输注方法,输注24小时后再分别抽取新鲜血液2ml。
1.3β-TG、GMP-140和PF4检测
将输注前后分别抽取的新鲜血液,3000×g离心20min,取上清液,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosor
-bent assay,ELISA)检测β-TG、GMP-140和PF4。试剂采用罗氏公司(Roche Diagnostics)的ELISA试剂盒,变异度分析控制在15%以内。
1.4血小板聚集功能
采用Born氏比浊法[5]检测输注前后血小板的聚集率,所用诱导剂的终浓度为花生四烯酸(arachidonic acid,AA)782.0µmol/L、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)47.6µmol/L和胶原(collagen)4.8mg/L。
1.5统计学分析
数据按公式“促凝功能变化=输注后促凝功能-输注前促凝功能”,以x±s表示,采用SPSS软件包进行完全随机化设计资料的方差分析。
2结果
2.1输注前后冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
图1 冰冻血小板和新鲜血小板β-TG的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
ELISA检测显示,输注冰冻血小板后β-TG为51.5±4.4ng/ml,输注新鲜血小板β-TG为40.3±4.0ng/ml,输注冰冻血小板后释放的β-TG高于新鲜血小板(P<0.05)(见图1)。
2.2输注前后冰冻血小板和新鲜血小板GMP-140的表达情况
ELISA检测结果表明,输注冰冻血小板后GMP-140为32.1±6.8ng/ml,输注新鲜血小板后机体GMP-140为24.3±4.8ng/ml,输注冰冻血小板后GMP-140高于新鲜血小板(P<0.05)(见图2)。
图2 冰冻血小板和新鲜血小板GMP-140的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
2.3输注前后冰冻血小板和新鲜血小板PF4的表达情况
ELISA检测结果表明,输注冰冻血小板后PF4为25.5±4.9ng/ml,输注新鲜血小板后PF4为18.8±3.6ng/ml,输注冰冻血小板后PF4高于新鲜血小板(P<0.05)(见图3)。
图3 冰冻血小板和新鲜血小板PF4的表达情况
*:与冰冻血小板相比,P<0.05
2.4输注冰冻血小板和新鲜血小板后机体的聚集功能
在AA、ADP和胶原的诱导下,冰冻血小板的聚集率均高于新鲜血小板(P<0.05～0.01)(见表1)。
表1 冰冻血小板和新鲜血小板的聚集率(%)
组别 诱聚剂
AA ADP 胶原
冰冻血小板
新鲜血小板 81.15±6.39
76.11±5.77* 83.04±6.09
76.59±5.30* 81.25±8.28
72.40±6.94**
注:*:与冰冻血小板相比,与P<0.05;**:与冰冻血小板相比,与P<0.01。
3讨论
血小板的功能包括粘附、聚集和促凝等方面,从广义上讲,血小板的粘附和聚集也属于促凝功能[6]。临床上,无论是静脉出血还是动脉出血,输注血小板的目的都是为了尽快止血,因而血小板的促凝功能是最关键的。
β-TG是血小板α颗粒合成的特异性蛋白,由四条肽链组成,通过抑制血管内皮细胞生成前列环素(prostacyclin,
PGI2)而发挥促凝作用[7]。由于β-TG主要存在于血小板中,因此测定血小板释放的β-TG已成为反映血小板促凝功能的一项指标。GMP-140是血小板激活脱颗粒反应中α颗粒释放的遗留产物,在血小板被激活时被释放出来,可促进细胞之间的连接,具有介导活性血小板与内皮细胞相互作用的功能,在凝血过程中起重要作用。因而GMP-140也是反映血小板促凝活性的分子标志物之一[8]。PF4是血小板α颗粒中的另外一种活性因子,为四聚体糖蛋白,由相同的70个氨基酸单体以共价键结合,单体的相对分子质量为7800。每个单体的N末端具有可变区,单体通过此区以两个二硫键锚定在PF4蛋白质核心上,此区由3个非平行β折叠和一个α螺旋结构组成[9]。PF4在血小板粘附、聚集、活化时以蛋白多糖复合物的形式从血小板中释放,能降低内皮细胞表面硫酸乙酰肝素的抗凝作用,并使血小板聚集,促进血液在血管内皮细胞表面凝固,因此PF4也是反映血小板促凝反应的标记物[10]。我们的研究结果表明,机体输注冰冻血小板后释放β-TG、GMP-140和PF4多于输注新鲜血小板,说明输注冰冻血小板后机体的促凝功能强于输注新鲜血小板。
我们在实验中还发现,在AA、ADP和胶原分别作为诱聚剂的情况下,输注冰冻血小板后的血液聚集率均高于输注新鲜血小板后。血小板聚集是血小板的主要功能之一,在止、凝血过程中,血小板聚集起着关键的作用[11]。因此,血小板聚集功能在一定程度上反映了血小板的促凝活性。此外,Owens[12]等报道患者输注新鲜血小板后,血小板的粘附能力只有输注冰冻血小板的53%,提示冰冻血小板的粘附功能也强于新鲜血小板。冰冻血小板的粘附能力和促凝活性增强可能与冰冻后血小板对于凝血因子V的结合能力增强有关。刘景汉[13]等通过观察大量血小板输注的临床病例,发现冰冻机采血小板的止血效果优于常规保存液体血小板,尤其是冰冻血小板输注取得了满意疗效。在该试验中,我们发现输注冰冻血小板后机体的促凝功能明显优于输注新鲜血小板后。我们在临床工作中也发现,冰冻血小板输血反应的发生率低于新鲜血小板,而且取得了较为满意的效果。滕本秀等[14]则通过临床实践,证实了冰冻新鲜血小板除了具有新鲜血小板的优点外,还具有保存期长,无污染危险,使用方便,随用随取等优点,因而更有利于危重出血患者的抢救治疗。但输注冰冻血小板之后,血小板计数的增加不及输注新鲜血小板后明显[15]。
综上所述,冰冻血小板的促凝血功能强于新鲜血小板,并且有充足的时间进行病毒检测,减少了传染性疾病传播的风险。虽然冰冻血小板在提升血小板计数方面不及新鲜血小板,但是在血源日趋紧张的今天,经深低温保存的冰冻血小板在安全性和止血效果方面均尤于新鲜血小板,可以大量长期储备,以满足临床应用血小板的需求。
参考文献
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[5] Born GV.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.Nature.1962 Jun 9;194:927.
[6] Polasek J.Procoagulant potential of platelet alpha granules.Platelets.2004,15(7):403-407.
[7] Lawler JW.Prediction of the secondary structure of platelet factor 4 and beta-thromboglobulin from their amino acid sequences.Thromb Res.1981,21(1-2):121-127.
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[10] Thachil J.The prothrombotic potential of platelet factor 4.Eur J Intern Med.2010,21(2):79-83.
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