论文部分内容阅读
摘要：为改善间接ELISA在Iss蛋白检测中的应用，将重组菌经IPTG诱导、分离，获得Iss融合蛋白。免疫雏鸡获得抗血清进行间接ELISA检测。采用甲醇处理、紫外线照射、调节反应物浓度、干燥等方法调节间接ELISA反应条件。结果表明，在封闭之前，先将包被板紫外线照射24 h，包被液包被蛋白或细菌37 ℃ 2 h后4 ℃过夜，56 ℃干燥 12 h，可改善间接ELISA检测结果。
关键词：Iss蛋白；抗血清；ELISA检测；大肠杆菌；优化条件
中图分类号： TS207文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0150-02
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常被称为大肠杆菌，属于肠道杆菌中的一种，当饲养环境差、通风不好、营养缺乏或应激等情况出现时会诱发畜禽大肠杆菌病，为人兽共患且危害食品安全[1]。Iss蛋白为大肠杆菌毒力岛的iss基因（increased serum survival gene）所编码的外膜蛋白，可增强大肠杆菌在血清中的存活能力，是大肠杆菌的重要毒力因子之一[2]。通过间接酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）检测细菌表面Iss蛋白的表达水平可能反映细菌对血清补体的抗性强弱。ELISA通过检测抗原、抗体及半抗原，在实际应用中可用作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定等，具有广阔的发展前景[3-4]。但是ELISA的影响因素较多，须进行检测条件的摸索、优化。为改善间接ELISA在大肠杆菌Iss蛋白检测中的应用，将重组菌经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，简称IPTG）诱导、分离，获得Iss融合蛋白；免疫雏鸡获得抗血清进行间接ELISA检测；采用甲醇处理、紫外线照射、调节反应物浓度、干燥等方法，进行ELISA的条件优化，为食品中大肠杆菌Iss蛋白的检测提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源
O2为Iss 致病性大肠杆菌，由东北农业大学动物医学院赠送，聊城大学食品安全教研室保存；pGEX-6p-1-iss/BL21（DE3）PlysS为重组菌，由东北农业大学动物医学院赠送，聊城大学食品安全教研室保存；BL21为感受态细菌，购自济南科赛特科技有限公司。
1.1.2雏鸡
1日龄无特定病原体（specific pathogen free，简称SPF）雏鸡购于山东省聊城市阳谷县养鸡场。
1.1.3主要试剂
LB液体培养基、IPTG、麦康凯培养基、伊红美篮培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；兔抗鸡IgY [KG-*3] （IgG）（H L）、四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，简称TMB）染色液，均购自Beyotime Biotechnology公司；脫脂奶粉，购自伊利乳业有限责任公司；其他试剂为分析纯。
1.2方法
1.2.1Iss融合蛋白诱导表达与检测
挑取活化的重组菌落接于含氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）50 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃摇床培养6 h。各取0.2 mL菌液接于20 mL LB液体培养基（体积比 1 ∶[KG-*3]100），37 ℃摇床培养3 h，测D600 nm值。各取2 mL菌液作诱导前对照，其他培养物加IPTG（终浓度分别为0.1、0.2、0.5 mmol/L），37 ℃摇床培养3 h，测D600 nm值[5]。各取2 mL菌液为诱导后样品，与诱导前样品均于12 000 r/min离心2～5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，简称PBS）洗涤2次，加入6×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）上样缓冲液，混匀，100 ℃煮沸5～10 min，-20 ℃保存，用于点样。将诱导后的样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE），电泳结束后卸下胶板，切去溴酚蓝条带，将胶放于考马斯亮蓝染色液染色1 h，脱色观察。
1.2.2融合蛋白的纯化
将诱导后的样品进行SDS-PAGE，电泳结束后卸下胶板，切去溴酚蓝条带，将胶放于去离子水中漂洗；再用PBS洗2遍，用0.25 mol/L KCl溶液染色 2～3 min，直至看见清晰条带；切下来放于1.5 mL离心管中，称质量；-20 ℃冻融，研磨至碎，凝胶与PBS按1 ∶[KG-*3]3的比例，将凝胶融化放于1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心取上清，经SDS-PAGE鉴定。按公式计算蛋白浓度：
1.2.3抗血清的制备
取灭过菌的2支试管，分别标记对照组、试验组，对照组加入PBS、弗氏佐剂，试验组加入融合蛋白、弗氏佐剂，乳化[6]。将1日龄SPF雏鸡饲养14 d，分为空白、对照、试验3组，每组10羽。空白组不作注射，对照组及试验组每隔1周免疫1次，第4次免疫后5 d取血。首次免疫佐剂为完全弗氏佐剂，第2次到第4次免疫佐剂为不完全弗氏佐剂。
1.2.4间接ELISA检测条件的优化
在实验室常规间接ELISA检测方法的基础上，对反应条件进行优化，具体条件如表1所示。
由图1可见，IPTG浓度为0.1 mmol/L时获得的带较宽，浓度为0.2、0.5 mmol/L时也有目的条带，但获得的目的条带比浓度为0.1 mmol/L时窄。表明IPTG浓度为0.1 mmol/L时，表达量最大。因此，选取0.1 mmol/L作为IPTG的诱导浓度。 2.2融合蛋白的纯化
经切胶纯化，取5 μL上清液，进行SDS-PAGE鉴定，在约36 ku处有特异条带（图2）。
[FK（W13][TPFC22.tif]
由图2可见，在36 ku处，有符合目的条带大小的特异条带，且为单一条带。表明通过纯化获得目的蛋白并且无杂蛋白。通过吸光度法检测在280、260 nm处的吸光值分别为 0.40、0.45，按蛋白浓度（mg/mL）=1.55×D280nm-0.76×D260 nm计算，得蛋白浓度为0.278 mg/mL。
2.3间接ELISA检测的优化
经96孔板预处理、包被条件、反应物浓度等方面的调节，计算ΔD450 nm=（D450 nm，阳性血清-D450 nm，空白）-（D450 nm，阴性血清-D450 nm，空白）。與常规间接ELISA检测ΔD450 nm相比，结果以优化试验组ΔD450 nm与常规方法组ΔD450 nm之差，即ΔΔD450 nm表示。结果表明，甲醇处理、洗涤次数、抗原浓度、一抗浓度、二抗浓度、稀释液种类，均对ΔΔD450 nm值无明显影响；紫外线照射包被板24 h、包被后56 ℃干燥12 h，对ΔΔD450 nm有明显影响（表2）。
由表2可见，紫外线照射包被板24 h，包被后先56 ℃干燥12 h再封闭，能明显升高ΔD450 nm差值；改变反应物浓度、甲醇处理、PBS稀释，对结果影响不明显。
优化条件：96孔板紫外线照射24 h，包被液包被蛋白或细菌37 ℃ 2 h后4℃过夜，56 ℃干燥12 h，封闭3 h，一抗稀释100倍，37 ℃温浴3 h，二抗稀释1 000倍，37 ℃温浴 2 h，加入显色液25 ℃放置1 h。
有研究者认为，iss基因编码的外膜蛋白Iss可能通过调节细胞表面上对补体膜攻击复合体敏感的位点，导致表面排斥，使菌株具有抗补体溶菌作用的能力，增强E. coli血清抗性[7]。而补体抗性又与毒力高度相关，是重要的致病因素[8]。多数研究者认为，Iss蛋白是结合在细胞表面的[7]，因此，本试验没有将菌体裂解而是采用全菌作为抗原包被，进行间接ELISA检测。庄翘楚等在试验中，采用包被抗体、二抗浓度、改变包被液、改变封闭液、调节封闭时间、调节TMB底物作用时间、改变单一变量进行ELISA的条件优化。如在包被抗体和二抗工作浓度、封闭液、底物和作用时间都一致的情况下，采用不同的包被液进行包被，以研究不同包被液对试验结果的影响。确定最佳条件：包被抗体1 ∶[KG-*3]1 280、二抗 1 ∶[KG-*3]320、N-溴代琥珀酰亚胺（N-bromobutanimide，简称NBS）作为包被液、质量分数为5%的BSA-PBS作为封闭液、封闭30 min、显色30 min[9]。Johnson等对ELISA检测中的常
见问题及解决方法进行了研究[10]。ELISA检测的影响因素较多，如标本、试剂、操作等[10]，这些因素导致了ELISA检测中的常见问题。本试验采用单因素试验对ELISA进行条件优化，结果表明，紫外线照射、干燥处理可明显升高ΔD450 nm。推测经紫外线照射、干燥处理增强了ELISA反应中抗原和/或细菌菌体与包被板的结合，使ΔD450 nm值升高。
3结论
优化条件为96孔板紫外线照射24 h，包被液包被蛋白或细菌37 ℃ 2 h后4 ℃过夜，56 ℃干燥12 h，封闭3 h，一抗稀释100倍，37 ℃温浴3 h，二抗稀释1 000倍，37 ℃温浴2 h，加入显色液25 ℃放置1 h，检测D450 nm。
参考文献：
[1]金文杰. 禽致病性大肠杆菌耐药基因和毒力因子的分子流行病学及HPI Irp1细胞表位作用的研究[D]. 扬州：扬州大学，2006.
[2]樊琛，王亚君，李一经. iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J]. 畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.
[3]刘纪成，吴海港，易先国，等. 豫南地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医杂志，2011，47（6）：43-45.[HJ1.75mm]
[4]樊琛，刘桂芹，王亚君，等. Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测[J]. 畜牧与兽医，2010，42（2）：71-73.
[5]朱善元，陆辉，王健，等. 禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测[J]. 微生报学报，2007，47（5）：795-799.
[6]王亚宾，王三虎，赵聘，等. 动物性食品检验学[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2003：346-347.
[7]樊琛，徐旺烨，李丹丹，等. PCR方法检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：69-70.
[8]李贵萧，朱宗涛，康燕青，等. 鸡大肠杆菌的血清抗性与致病性检验[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：301-303.
[9]庄翘楚，孟祥晨. 双抗夹心ELISA法检测双歧杆菌反应条件的优化[J]. 中国乳品工业，2008，36（5）：55-58.
[10]Johnson T J，Kariyawasam S，Wannemuehler Y，et al. The genome sequence of avian pathogenic Escherichia coli strain O1：K1：H7 shares strong similarities with human extraintestinal pathogenic E. coli genomes[J]. Journal of Bacteriology，2007，189（8）：3228-3236.
关键词：Iss蛋白；抗血清；ELISA检测；大肠杆菌；优化条件
中图分类号： TS207文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0150-02
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常被称为大肠杆菌，属于肠道杆菌中的一种，当饲养环境差、通风不好、营养缺乏或应激等情况出现时会诱发畜禽大肠杆菌病，为人兽共患且危害食品安全[1]。Iss蛋白为大肠杆菌毒力岛的iss基因（increased serum survival gene）所编码的外膜蛋白，可增强大肠杆菌在血清中的存活能力，是大肠杆菌的重要毒力因子之一[2]。通过间接酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）检测细菌表面Iss蛋白的表达水平可能反映细菌对血清补体的抗性强弱。ELISA通过检测抗原、抗体及半抗原，在实际应用中可用作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定等，具有广阔的发展前景[3-4]。但是ELISA的影响因素较多，须进行检测条件的摸索、优化。为改善间接ELISA在大肠杆菌Iss蛋白检测中的应用，将重组菌经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，简称IPTG）诱导、分离，获得Iss融合蛋白；免疫雏鸡获得抗血清进行间接ELISA检测；采用甲醇处理、紫外线照射、调节反应物浓度、干燥等方法，进行ELISA的条件优化，为食品中大肠杆菌Iss蛋白的检测提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源
O2为Iss 致病性大肠杆菌，由东北农业大学动物医学院赠送，聊城大学食品安全教研室保存；pGEX-6p-1-iss/BL21（DE3）PlysS为重组菌，由东北农业大学动物医学院赠送，聊城大学食品安全教研室保存；BL21为感受态细菌，购自济南科赛特科技有限公司。
1.1.2雏鸡
1日龄无特定病原体（specific pathogen free，简称SPF）雏鸡购于山东省聊城市阳谷县养鸡场。
1.1.3主要试剂
LB液体培养基、IPTG、麦康凯培养基、伊红美篮培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；兔抗鸡IgY [KG-*3] （IgG）（H L）、四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，简称TMB）染色液，均购自Beyotime Biotechnology公司；脫脂奶粉，购自伊利乳业有限责任公司；其他试剂为分析纯。
1.2方法
1.2.1Iss融合蛋白诱导表达与检测
挑取活化的重组菌落接于含氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）50 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃摇床培养6 h。各取0.2 mL菌液接于20 mL LB液体培养基（体积比 1 ∶[KG-*3]100），37 ℃摇床培养3 h，测D600 nm值。各取2 mL菌液作诱导前对照，其他培养物加IPTG（终浓度分别为0.1、0.2、0.5 mmol/L），37 ℃摇床培养3 h，测D600 nm值[5]。各取2 mL菌液为诱导后样品，与诱导前样品均于12 000 r/min离心2～5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，简称PBS）洗涤2次，加入6×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）上样缓冲液，混匀，100 ℃煮沸5～10 min，-20 ℃保存，用于点样。将诱导后的样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE），电泳结束后卸下胶板，切去溴酚蓝条带，将胶放于考马斯亮蓝染色液染色1 h，脱色观察。
1.2.2融合蛋白的纯化
将诱导后的样品进行SDS-PAGE，电泳结束后卸下胶板，切去溴酚蓝条带，将胶放于去离子水中漂洗；再用PBS洗2遍，用0.25 mol/L KCl溶液染色 2～3 min，直至看见清晰条带；切下来放于1.5 mL离心管中，称质量；-20 ℃冻融，研磨至碎，凝胶与PBS按1 ∶[KG-*3]3的比例，将凝胶融化放于1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心取上清，经SDS-PAGE鉴定。按公式计算蛋白浓度：
1.2.3抗血清的制备
取灭过菌的2支试管，分别标记对照组、试验组，对照组加入PBS、弗氏佐剂，试验组加入融合蛋白、弗氏佐剂，乳化[6]。将1日龄SPF雏鸡饲养14 d，分为空白、对照、试验3组，每组10羽。空白组不作注射，对照组及试验组每隔1周免疫1次，第4次免疫后5 d取血。首次免疫佐剂为完全弗氏佐剂，第2次到第4次免疫佐剂为不完全弗氏佐剂。
1.2.4间接ELISA检测条件的优化
在实验室常规间接ELISA检测方法的基础上，对反应条件进行优化，具体条件如表1所示。
由图1可见，IPTG浓度为0.1 mmol/L时获得的带较宽，浓度为0.2、0.5 mmol/L时也有目的条带，但获得的目的条带比浓度为0.1 mmol/L时窄。表明IPTG浓度为0.1 mmol/L时，表达量最大。因此，选取0.1 mmol/L作为IPTG的诱导浓度。 2.2融合蛋白的纯化
经切胶纯化，取5 μL上清液，进行SDS-PAGE鉴定，在约36 ku处有特异条带（图2）。
[FK（W13][TPFC22.tif]
由图2可见，在36 ku处，有符合目的条带大小的特异条带，且为单一条带。表明通过纯化获得目的蛋白并且无杂蛋白。通过吸光度法检测在280、260 nm处的吸光值分别为 0.40、0.45，按蛋白浓度（mg/mL）=1.55×D280nm-0.76×D260 nm计算，得蛋白浓度为0.278 mg/mL。
2.3间接ELISA检测的优化
经96孔板预处理、包被条件、反应物浓度等方面的调节，计算ΔD450 nm=（D450 nm，阳性血清-D450 nm，空白）-（D450 nm，阴性血清-D450 nm，空白）。與常规间接ELISA检测ΔD450 nm相比，结果以优化试验组ΔD450 nm与常规方法组ΔD450 nm之差，即ΔΔD450 nm表示。结果表明，甲醇处理、洗涤次数、抗原浓度、一抗浓度、二抗浓度、稀释液种类，均对ΔΔD450 nm值无明显影响；紫外线照射包被板24 h、包被后56 ℃干燥12 h，对ΔΔD450 nm有明显影响（表2）。
由表2可见，紫外线照射包被板24 h，包被后先56 ℃干燥12 h再封闭，能明显升高ΔD450 nm差值；改变反应物浓度、甲醇处理、PBS稀释，对结果影响不明显。
优化条件：96孔板紫外线照射24 h，包被液包被蛋白或细菌37 ℃ 2 h后4℃过夜，56 ℃干燥12 h，封闭3 h，一抗稀释100倍，37 ℃温浴3 h，二抗稀释1 000倍，37 ℃温浴 2 h，加入显色液25 ℃放置1 h。
有研究者认为，iss基因编码的外膜蛋白Iss可能通过调节细胞表面上对补体膜攻击复合体敏感的位点，导致表面排斥，使菌株具有抗补体溶菌作用的能力，增强E. coli血清抗性[7]。而补体抗性又与毒力高度相关，是重要的致病因素[8]。多数研究者认为，Iss蛋白是结合在细胞表面的[7]，因此，本试验没有将菌体裂解而是采用全菌作为抗原包被，进行间接ELISA检测。庄翘楚等在试验中，采用包被抗体、二抗浓度、改变包被液、改变封闭液、调节封闭时间、调节TMB底物作用时间、改变单一变量进行ELISA的条件优化。如在包被抗体和二抗工作浓度、封闭液、底物和作用时间都一致的情况下，采用不同的包被液进行包被，以研究不同包被液对试验结果的影响。确定最佳条件：包被抗体1 ∶[KG-*3]1 280、二抗 1 ∶[KG-*3]320、N-溴代琥珀酰亚胺（N-bromobutanimide，简称NBS）作为包被液、质量分数为5%的BSA-PBS作为封闭液、封闭30 min、显色30 min[9]。Johnson等对ELISA检测中的常
见问题及解决方法进行了研究[10]。ELISA检测的影响因素较多，如标本、试剂、操作等[10]，这些因素导致了ELISA检测中的常见问题。本试验采用单因素试验对ELISA进行条件优化，结果表明，紫外线照射、干燥处理可明显升高ΔD450 nm。推测经紫外线照射、干燥处理增强了ELISA反应中抗原和/或细菌菌体与包被板的结合，使ΔD450 nm值升高。
3结论
优化条件为96孔板紫外线照射24 h，包被液包被蛋白或细菌37 ℃ 2 h后4 ℃过夜，56 ℃干燥12 h，封闭3 h，一抗稀释100倍，37 ℃温浴3 h，二抗稀释1 000倍，37 ℃温浴2 h，加入显色液25 ℃放置1 h，检测D450 nm。
参考文献：
[1]金文杰. 禽致病性大肠杆菌耐药基因和毒力因子的分子流行病学及HPI Irp1细胞表位作用的研究[D]. 扬州：扬州大学，2006.
[2]樊琛，王亚君，李一经. iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J]. 畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.
[3]刘纪成，吴海港，易先国，等. 豫南地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国兽医杂志，2011，47（6）：43-45.[HJ1.75mm]
[4]樊琛，刘桂芹，王亚君，等. Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测[J]. 畜牧与兽医，2010，42（2）：71-73.
[5]朱善元，陆辉，王健，等. 禽源大肠杆菌的分离及其毒力因子的检测[J]. 微生报学报，2007，47（5）：795-799.
[6]王亚宾，王三虎，赵聘，等. 动物性食品检验学[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2003：346-347.
[7]樊琛，徐旺烨，李丹丹，等. PCR方法检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：69-70.
[8]李贵萧，朱宗涛，康燕青，等. 鸡大肠杆菌的血清抗性与致病性检验[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：301-303.
[9]庄翘楚，孟祥晨. 双抗夹心ELISA法检测双歧杆菌反应条件的优化[J]. 中国乳品工业，2008，36（5）：55-58.
[10]Johnson T J，Kariyawasam S，Wannemuehler Y，et al. The genome sequence of avian pathogenic Escherichia coli strain O1：K1：H7 shares strong similarities with human extraintestinal pathogenic E. coli genomes[J]. Journal of Bacteriology，2007，189（8）：3228-3236.