【摘 要】
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将自肾脏cDNA中获得的人激肽释放酶-1(Human kallikrein1,hK1)基因插入到pPICZαA载体中,构建甲醇酵母分泌型表达载体pPICZα-hK1,该载体转化毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主
【机 构】
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上海万兴生物制药有限公司新药开发部
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将自肾脏cDNA中获得的人激肽释放酶-1(Human kallikrein1,hK1)基因插入到pPICZαA载体中,构建甲醇酵母分泌型表达载体pPICZα-hK1,该载体转化毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X33,通过提高YPD平板和培养液中抗生素Zeocin的浓度(500~700μg/mL),筛选能高水平表达重组人激肽释放酶-1(Recombinant human kallikrein1,rhK1)的P.pastoris工程菌株。在30L发酵罐中发酵的表达条件为30oC、pH6.0,诱导64h时,发酵上清中rhK1产量达到6500u/L(约1.25g/L)。表达的rhK1有N-型糖基化程度不同的两种类型,分别是分子量偏大的rhK1-H和分子量略小的rhK1-L。通过苯基疏水作用、Cu2+螯合以及阴离子交换层析纯化,从每升发酵上清中可获得0.28g的rhK1-H和0.62g的rhK1-L,纯化的总得率约为72%,纯度不低于96%。到目前为止,该研究获得的rhK1产量高于其他研究者的结果。
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