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[摘 要]葡萄球菌是存在于人类和其他哺乳动物上皮表面上的共生细菌。包括危险病原体金黄色葡萄球菌在内的许多葡萄球菌在破坏上皮屏障时可引起严重的疾病。无论是在共生期间还是在感染期间葡萄球菌都需要躲避先天宿主防御机制，而抗菌肽尤其是在皮肤上的抗菌肽在这里扮演着重要角色。葡萄球菌进化出抵御抗菌肽杀菌活性的机制是多方面的，包括排斥抗菌肽细胞膜表面正电荷，防止蛋白水解，失活，分泌等。此外，许多葡萄球菌形成了生物膜，代表着另外一种阻止包括抗菌肽在内抗菌药物进入细菌的方式。这篇文章提出了一个特殊的问题，即细菌对抗菌肽的耐药性。
[关键词]葡萄球菌，抗菌肽，耐药机制
中图分类号：R378 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）14-0359-01
1.简介
葡萄球菌成为医疗保健和社区机构中感染的主要原因[1]。抗生素耐药性在葡萄球菌中是广泛的并且极大的增加了治疗的复杂性。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），据估计它在美国每年造成近20000人死亡，这比HIV/AIDS的报道还要多[2]。
葡萄球菌感染主要来自于外来菌株。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性表皮葡萄球菌是侵入人类鼻子和皮肤最常见的共生细菌。大约30%的人口携带金黄色葡萄球菌并且有20%是持久携带者。重要的是，现已经证明金黄色葡萄球菌定植构成了后续感染的风险。当人类上皮细胞的保护层被破坏时宿主免疫机制失效，葡萄球菌感染导致的疾病例如菌血症或肺炎则会变得极其危险并有可能危及生命。
先天免疫系统在对抗葡萄球菌感染中起着重要作用。抗菌肽在人类皮肤上代表着先天免疫防御的第一道防线，也成为了吞噬作用发生后中性粒细胞吞噬体消除细菌机制的一部分。包括人类在内的许多不同的生物都可以产生抗菌肽，我们已经发现许多人源抗菌肽对葡萄球菌都是有活性的。人类抗菌肽可以分为两个家族：防御素和导管素。所有这些肽都带有正电荷，因此统称为阳离子抗菌肽。另一个来自于人的带有净负电荷的阴离子肽叫做皮离蛋白，它最初是从人类汗液中分离出来的。
随着人类抗菌肽的逐步进化并在先天免疫中发挥关键作用，葡萄球菌作为人类入侵者也在入侵和感染中进化出通用的策略来逃避抗菌肽活性。这包括很多方面，例如表面电荷改变，细胞外蛋白酶，多聚糖和外排泵蛋白机制，由特异性的传感/调节系统调控的机制等。本文将概述葡萄球菌对抗菌肽耐药的策略。
2.葡萄球菌逃避抗菌肽杀菌策略
2.1MprF磷脂酰甘油的氨酰化
磷脂中的磷脂酰甘油和卵磷脂是细菌细胞质膜的主要脂质成分，他们都是阴离子带有负净电荷，可吸附阳离子抗菌肽。葡萄球菌和其他一些细菌有一种叫做MprF（多肽耐藥因子）的基因，其蛋白产物，它通过在PG甘油部分和赖氨酸或者丙氨酸的羧基之间形成酯键来成为PG氨酰化的原因，这可以导致细菌细胞膜负电荷的减少，从而衰减阳离子抗菌肽的吸附作用。然而由于MprF的酶活力作用，葡萄球菌MprF只产生赖氨酰化的磷脂酰甘油（Lys-PG），其他细菌产生丙氨酰化的磷脂酰甘油（Ala-PG）或者二者都产生。
MprF是14个跨膜域（TMDs）的膜蛋白组成。MprF的C-末端6个结构域通过招募PG和赖氨酰-tRNA作为基底来产生Lys-PG。N-末端的6个结构域把Lys-PG从内部小叶改变到外部小叶，其活性代表细菌磷脂翻转酶的第一步。所有结构域都是抗菌肽耐药必须的。通过不同来源的Ala-PG合成酶结构域和Lys-PG 翻转酶结构域共同表达，我们最近发现翻转酶结构域负责MprF底物专一性。重要的是有报道称mprF特异性区域的点突变导致对达托霉素耐药，这是对多药耐药细菌最后能使用的脂肽抗生素，而且有多个研究表明mprF的点突变与临床分离的和实验室中细菌对达托霉素耐药有关联。在最近一次比较研究中对达托霉素敏感及耐药的金黄色葡萄球菌中，基于MprF表型的特异性点突变在获得达托霉素耐药性中起到重要作用。最后，氨酰基-PG水解酶在屎肠球菌和铜绿假单胞菌中都有出现。最近研究发现水解酶在这两种菌株中都能将氨酰基-PG降解成PG来保持脂膜的氨酰化水平，它也表现出额外功能例如对抗菌肽耐药以及细胞生长。这一发现对于氨酰基-PG内稳态是如何获得一种或多种变异以及如何影响抗菌化合物耐药等问题提供了新的解决方法。虽然在葡萄球菌中还没有发现相应的酶，受水解酶活性影响的氨酰基-PG内稳态需要与像MprF一样的氨酰基-PG合成酶共同研究，从而更好的理解葡萄球菌对抗菌肽的研究机制。
2.2多聚糖及生物膜
胞间多糖粘附素（PIA，也称为PNAG）是一种由金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌以及其他葡萄球菌icaADBC操纵子产生的阳离子胞外多糖。在其他不同细菌中也存在相应系统。PIA / PNAG是一种部分去乙酰化的N-乙酰葡糖胺线性均聚物。重要的是，去乙酰化的 IcaB可导致PIA / PNAG带净正电荷的，这对抗菌肽耐药性是至关重要的。另外一个重要的细菌多聚糖，聚γ谷氨酸（PGA）是除金黄色葡萄球菌外的凝固酶阴性葡球菌以及其他种类细菌产生的，其中capBCAD操纵子负责PGA的产生。有趣的是，PIA/PNAG和PGA无论是对阳离子还是阴离子人源抗菌肽例如LL-37、HBD3和皮离蛋白都能起到保护作用，尽管那些肽具有相反的静电荷。这表明，抗菌肽在这两种多聚糖帮助之下的耐药机制并不是只有简单的静电排斥，还包括基于静电隔离或者独立电荷的机械屏障功能。此外，两者都有助于躲避嗜中性粒细胞的吞噬作用。最近在表皮葡萄球菌中发现了另一种部分硫酸化的PIA/PNAG，其生物学作用和生物合成途径仍需阐明。
PIA/PNAG和PGA都能在体内模型中造成葡萄球菌膜相关内在医疗器械感染，但只有PIA/PNAG已被证明影响体外生物膜的形成。而通过表皮葡萄球菌生物膜cap操纵子在基因表达的全组基因分析中表现出上调，我们可以分析出PGA在生物膜特异性抗菌肽耐药中起到重要作用。值得注意的是，因为除了抗菌肽耐药之外，PIA/PNAG在体外生物膜形成和体内生物膜相关感染中起到了至关重要的作用，可以从两个方面机制来解释抗菌肽耐药性，即作为一个表面的多聚糖抵制阳离子抗菌肽，另外作为生物膜基质的组成成分可能与其他葡萄球菌多聚糖共有双重作用机制。 2.3细胞外基质蛋白
葡萄球菌产生一系列蛋白酶，如金黄色葡萄球菌V8蛋白酶或aureolysin，我们已知其中一些可以降解人源抗菌肽。Aureolysin是一种依赖于锌离子的带有较低底物特异性的金属蛋白酶。其在表皮葡萄球菌中的同源物是SepA，编码sepA基因。众所周知aureolysin类的蛋白酶能使所发现的人类唯一抗菌肽LL-37失去活性。相反，丝氨酸蛋白酶V8受sspA基因编码，能降解LL-37，但据报导产生的碎片仍对表皮葡萄球菌有活性。此外，上面已经提到，表皮葡萄球菌SepA有助于躲避嗜中性粒细胞杀菌作用，它可能通过在中性粒细胞噬菌体中灭活抗菌肽并且有其他蛋白依赖的杀菌机制。值得注意的是，葡萄球菌包括V8和表皮葡萄球菌Esp在内的丝氨酸蛋白酶也在躲避人免疫防御中起到了重要作用，例如α1蛋白酶、补体组成5、纤维蛋白原。最后，这些蛋白酶的表达主要是agr的上调和sarA抑制，导致这些调节系统在抗菌肽耐药中产生重要影响。
金黄色葡萄球菌也分泌葡挞球菌激酶，隔绝α-防御素。几十年来，纤溶酶原的活化成为葡萄球菌激酶的唯一已知功能直到在葡萄球菌激酶中发现与纤溶酶原结合位点不同的多结合位点HNPs。含葡萄球菌激酶的复合体中α防御素的杀菌活性明显低于不含葡萄球菌激酶的，这种影响不依赖与纤溶酶原。此外，葡萄球菌激酶结合LL-37可以增强纤溶酶原激活和纤维蛋白溶解。
此外，葡萄球菌胞外酶也在躲避中性粒细胞胞外菌网中扮演着重要的角色。一些中性粒细胞随着NETs构建中组蛋白和颗粒蛋白的修饰释放DNA。这一过程也成为NETosis，通过捕获和杀死外源微生物帮助免疫细胞保护自身远离细菌入侵。最近研究揭示了金黄色葡萄球菌逃离NETs的新策略，即胞外核酸酶和腺苷合酶A降解并合成2-脫氧腺苷来促进巨噬细胞凋亡。
3.结论和展望
葡萄球菌对抗菌肽有多种耐药机制，其中包括复杂的感应和调控机制，令人吃惊的是，许多机制还有额外的生物学功能。例如，PIA / PNAG在抗菌肽耐药中扮演非常重要的角色，但也是细菌侵袭和生物膜形成的必要成分。此外葡萄球菌受益于多种非特异性失活抗菌肽分泌的蛋白酶，这些蛋白酶肯定还有许多其他生物功能，比如降解宿主组织来获得营养。尽管葡萄球菌作为人和哺乳动物共生菌在进化中会长时间与抗菌肽接触，我们仍可以猜测一些由葡萄球菌引起的抗菌肽耐药机制可能由其他原有机制进化而来，因为由葡萄球菌引起抗菌肽耐药的保护因素相当少。因此，因此，抗菌肽耐药机制可能需要进一步研究细菌发病机理和普通生理学。
脂肽类抗生素达托霉素与抗菌肽有相似的细菌耐药机制，研究由葡萄球菌引起的耐抗菌肽机制比只研究抗菌肽耐药机制更有意义。对抗菌肽或者说抗葡萄球菌试剂耐药机制的进一步理解有助于增强对临床重要的抗生素研发的准备。此外，抗菌肽还常常被用作新型抗菌药物，尤其用在对单一杀菌剂高度耐药的生物膜感染方面。从对抗菌肽耐药的研究中我们也可以进一步预测对相关试剂潜在耐药机制的扩散，以及是否可以用于治疗疾病。最后，抗菌肽耐药机制本身可能对抗菌药物的研究有代表性意义。
参考文献
[1] A.C. Uhlemann， M. Otto， F.D. Lowy， F.R. DeLeo， Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus， Infect. Genet. Evol. 21 （2014） 563–574.
[2] F.R. DeLeo， H.F. Chambers， Reemergence of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus in the genomics era， J. Clin. Invest. 119 （2009） 2464–2474.
[关键词]葡萄球菌，抗菌肽，耐药机制
中图分类号：R378 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）14-0359-01
1.简介
葡萄球菌成为医疗保健和社区机构中感染的主要原因[1]。抗生素耐药性在葡萄球菌中是广泛的并且极大的增加了治疗的复杂性。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），据估计它在美国每年造成近20000人死亡，这比HIV/AIDS的报道还要多[2]。
葡萄球菌感染主要来自于外来菌株。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性表皮葡萄球菌是侵入人类鼻子和皮肤最常见的共生细菌。大约30%的人口携带金黄色葡萄球菌并且有20%是持久携带者。重要的是，现已经证明金黄色葡萄球菌定植构成了后续感染的风险。当人类上皮细胞的保护层被破坏时宿主免疫机制失效，葡萄球菌感染导致的疾病例如菌血症或肺炎则会变得极其危险并有可能危及生命。
先天免疫系统在对抗葡萄球菌感染中起着重要作用。抗菌肽在人类皮肤上代表着先天免疫防御的第一道防线，也成为了吞噬作用发生后中性粒细胞吞噬体消除细菌机制的一部分。包括人类在内的许多不同的生物都可以产生抗菌肽，我们已经发现许多人源抗菌肽对葡萄球菌都是有活性的。人类抗菌肽可以分为两个家族：防御素和导管素。所有这些肽都带有正电荷，因此统称为阳离子抗菌肽。另一个来自于人的带有净负电荷的阴离子肽叫做皮离蛋白，它最初是从人类汗液中分离出来的。
随着人类抗菌肽的逐步进化并在先天免疫中发挥关键作用，葡萄球菌作为人类入侵者也在入侵和感染中进化出通用的策略来逃避抗菌肽活性。这包括很多方面，例如表面电荷改变，细胞外蛋白酶，多聚糖和外排泵蛋白机制，由特异性的传感/调节系统调控的机制等。本文将概述葡萄球菌对抗菌肽耐药的策略。
2.葡萄球菌逃避抗菌肽杀菌策略
2.1MprF磷脂酰甘油的氨酰化
磷脂中的磷脂酰甘油和卵磷脂是细菌细胞质膜的主要脂质成分，他们都是阴离子带有负净电荷，可吸附阳离子抗菌肽。葡萄球菌和其他一些细菌有一种叫做MprF（多肽耐藥因子）的基因，其蛋白产物，它通过在PG甘油部分和赖氨酸或者丙氨酸的羧基之间形成酯键来成为PG氨酰化的原因，这可以导致细菌细胞膜负电荷的减少，从而衰减阳离子抗菌肽的吸附作用。然而由于MprF的酶活力作用，葡萄球菌MprF只产生赖氨酰化的磷脂酰甘油（Lys-PG），其他细菌产生丙氨酰化的磷脂酰甘油（Ala-PG）或者二者都产生。
MprF是14个跨膜域（TMDs）的膜蛋白组成。MprF的C-末端6个结构域通过招募PG和赖氨酰-tRNA作为基底来产生Lys-PG。N-末端的6个结构域把Lys-PG从内部小叶改变到外部小叶，其活性代表细菌磷脂翻转酶的第一步。所有结构域都是抗菌肽耐药必须的。通过不同来源的Ala-PG合成酶结构域和Lys-PG 翻转酶结构域共同表达，我们最近发现翻转酶结构域负责MprF底物专一性。重要的是有报道称mprF特异性区域的点突变导致对达托霉素耐药，这是对多药耐药细菌最后能使用的脂肽抗生素，而且有多个研究表明mprF的点突变与临床分离的和实验室中细菌对达托霉素耐药有关联。在最近一次比较研究中对达托霉素敏感及耐药的金黄色葡萄球菌中，基于MprF表型的特异性点突变在获得达托霉素耐药性中起到重要作用。最后，氨酰基-PG水解酶在屎肠球菌和铜绿假单胞菌中都有出现。最近研究发现水解酶在这两种菌株中都能将氨酰基-PG降解成PG来保持脂膜的氨酰化水平，它也表现出额外功能例如对抗菌肽耐药以及细胞生长。这一发现对于氨酰基-PG内稳态是如何获得一种或多种变异以及如何影响抗菌化合物耐药等问题提供了新的解决方法。虽然在葡萄球菌中还没有发现相应的酶，受水解酶活性影响的氨酰基-PG内稳态需要与像MprF一样的氨酰基-PG合成酶共同研究，从而更好的理解葡萄球菌对抗菌肽的研究机制。
2.2多聚糖及生物膜
胞间多糖粘附素（PIA，也称为PNAG）是一种由金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌以及其他葡萄球菌icaADBC操纵子产生的阳离子胞外多糖。在其他不同细菌中也存在相应系统。PIA / PNAG是一种部分去乙酰化的N-乙酰葡糖胺线性均聚物。重要的是，去乙酰化的 IcaB可导致PIA / PNAG带净正电荷的，这对抗菌肽耐药性是至关重要的。另外一个重要的细菌多聚糖，聚γ谷氨酸（PGA）是除金黄色葡萄球菌外的凝固酶阴性葡球菌以及其他种类细菌产生的，其中capBCAD操纵子负责PGA的产生。有趣的是，PIA/PNAG和PGA无论是对阳离子还是阴离子人源抗菌肽例如LL-37、HBD3和皮离蛋白都能起到保护作用，尽管那些肽具有相反的静电荷。这表明，抗菌肽在这两种多聚糖帮助之下的耐药机制并不是只有简单的静电排斥，还包括基于静电隔离或者独立电荷的机械屏障功能。此外，两者都有助于躲避嗜中性粒细胞的吞噬作用。最近在表皮葡萄球菌中发现了另一种部分硫酸化的PIA/PNAG，其生物学作用和生物合成途径仍需阐明。
PIA/PNAG和PGA都能在体内模型中造成葡萄球菌膜相关内在医疗器械感染，但只有PIA/PNAG已被证明影响体外生物膜的形成。而通过表皮葡萄球菌生物膜cap操纵子在基因表达的全组基因分析中表现出上调，我们可以分析出PGA在生物膜特异性抗菌肽耐药中起到重要作用。值得注意的是，因为除了抗菌肽耐药之外，PIA/PNAG在体外生物膜形成和体内生物膜相关感染中起到了至关重要的作用，可以从两个方面机制来解释抗菌肽耐药性，即作为一个表面的多聚糖抵制阳离子抗菌肽，另外作为生物膜基质的组成成分可能与其他葡萄球菌多聚糖共有双重作用机制。 2.3细胞外基质蛋白
葡萄球菌产生一系列蛋白酶，如金黄色葡萄球菌V8蛋白酶或aureolysin，我们已知其中一些可以降解人源抗菌肽。Aureolysin是一种依赖于锌离子的带有较低底物特异性的金属蛋白酶。其在表皮葡萄球菌中的同源物是SepA，编码sepA基因。众所周知aureolysin类的蛋白酶能使所发现的人类唯一抗菌肽LL-37失去活性。相反，丝氨酸蛋白酶V8受sspA基因编码，能降解LL-37，但据报导产生的碎片仍对表皮葡萄球菌有活性。此外，上面已经提到，表皮葡萄球菌SepA有助于躲避嗜中性粒细胞杀菌作用，它可能通过在中性粒细胞噬菌体中灭活抗菌肽并且有其他蛋白依赖的杀菌机制。值得注意的是，葡萄球菌包括V8和表皮葡萄球菌Esp在内的丝氨酸蛋白酶也在躲避人免疫防御中起到了重要作用，例如α1蛋白酶、补体组成5、纤维蛋白原。最后，这些蛋白酶的表达主要是agr的上调和sarA抑制，导致这些调节系统在抗菌肽耐药中产生重要影响。
金黄色葡萄球菌也分泌葡挞球菌激酶，隔绝α-防御素。几十年来，纤溶酶原的活化成为葡萄球菌激酶的唯一已知功能直到在葡萄球菌激酶中发现与纤溶酶原结合位点不同的多结合位点HNPs。含葡萄球菌激酶的复合体中α防御素的杀菌活性明显低于不含葡萄球菌激酶的，这种影响不依赖与纤溶酶原。此外，葡萄球菌激酶结合LL-37可以增强纤溶酶原激活和纤维蛋白溶解。
此外，葡萄球菌胞外酶也在躲避中性粒细胞胞外菌网中扮演着重要的角色。一些中性粒细胞随着NETs构建中组蛋白和颗粒蛋白的修饰释放DNA。这一过程也成为NETosis，通过捕获和杀死外源微生物帮助免疫细胞保护自身远离细菌入侵。最近研究揭示了金黄色葡萄球菌逃离NETs的新策略，即胞外核酸酶和腺苷合酶A降解并合成2-脫氧腺苷来促进巨噬细胞凋亡。
3.结论和展望
葡萄球菌对抗菌肽有多种耐药机制，其中包括复杂的感应和调控机制，令人吃惊的是，许多机制还有额外的生物学功能。例如，PIA / PNAG在抗菌肽耐药中扮演非常重要的角色，但也是细菌侵袭和生物膜形成的必要成分。此外葡萄球菌受益于多种非特异性失活抗菌肽分泌的蛋白酶，这些蛋白酶肯定还有许多其他生物功能，比如降解宿主组织来获得营养。尽管葡萄球菌作为人和哺乳动物共生菌在进化中会长时间与抗菌肽接触，我们仍可以猜测一些由葡萄球菌引起的抗菌肽耐药机制可能由其他原有机制进化而来，因为由葡萄球菌引起抗菌肽耐药的保护因素相当少。因此，因此，抗菌肽耐药机制可能需要进一步研究细菌发病机理和普通生理学。
脂肽类抗生素达托霉素与抗菌肽有相似的细菌耐药机制，研究由葡萄球菌引起的耐抗菌肽机制比只研究抗菌肽耐药机制更有意义。对抗菌肽或者说抗葡萄球菌试剂耐药机制的进一步理解有助于增强对临床重要的抗生素研发的准备。此外，抗菌肽还常常被用作新型抗菌药物，尤其用在对单一杀菌剂高度耐药的生物膜感染方面。从对抗菌肽耐药的研究中我们也可以进一步预测对相关试剂潜在耐药机制的扩散，以及是否可以用于治疗疾病。最后，抗菌肽耐药机制本身可能对抗菌药物的研究有代表性意义。
参考文献
[1] A.C. Uhlemann， M. Otto， F.D. Lowy， F.R. DeLeo， Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus， Infect. Genet. Evol. 21 （2014） 563–574.
[2] F.R. DeLeo， H.F. Chambers， Reemergence of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus in the genomics era， J. Clin. Invest. 119 （2009） 2464–2474.