【摘 要】
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目的 建立荧光环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法。方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列（GenBank:69901515），使用引物设计软件PrimerExplorerV5.0获得LAMP引物。在LAMP体系中加入荧光染料，对引物、MgSO4、甜菜碱、dNTP、BstD
【机 构】
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广州市微米生物科技有限公司广东省神经免疫性疾病多重荧光精准诊断工程技术研究中心
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目的 建立荧光环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法。方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列（GenBank:69901515），使用引物设计软件PrimerExplorerV5.0获得LAMP引物。在LAMP体系中加入荧光染料，对引物、MgSO4、甜菜碱、dNTP、BstDNA聚合酶的使用浓度进行了筛选，MgSO4浓度范围为0～12mmol/L、甜菜碱浓度范围为0～2.4mol/L、dNTP浓度范围为0.2～2μmol/L、FIP和BIP浓度范围为0.2～2μmol/L、F3和B3浓度范围为0.2～0.4μmol/L、BstDNA聚合酶浓度范围为0.16～0.96U/μL、荧光染料浓度范围为0.2～2μmol/L。以优化后体系，在ABI7500实时荧光定量PCR分析仪上评估方法学特异性和最低检出限，检测了12种标准菌株包括A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌、G群链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、淋病奈瑟菌、嗜酸乳杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，最后检测了103例临床样本。结果 反应体系以25μL为宜，包含25μmol/L的荧光染料0.8μL、100mmol/L的MgSO41μL、5mol/L的甜菜碱6μL、25mmol/L的dNTP1.4μL、20μmol/L的FIP和BIP各2 μL、20 μmol/L的F3和B3各0.5 μL、8 U/μL的Bst DNA聚合酶1 μL 63 ℃反应45分钟即可完成；最低检出限为500 pg/μL；检测12株非化脓性链球菌株，均为阴性结果。103例临床样本结果与培养法比较，临床灵敏度为100.0%（16/16），特异性为96.6%（84/87）。结论 该法检测化脓性链球菌的特异性和灵敏度较好，且操作简单，能满足临床需求，适宜现场检测及基层推广。
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