基因组改组选育类球红细菌辅酶Q10高产菌株

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从实验室保藏菌株中筛选出1株辅酶Q1o产生菌NM-FZ-47,辅酶Q1o产量为63.4mg/L。首先对辅酶Q1o测定方法进行研究,采用3种不同的测定方法分别测定辅酶Q1o,结果表明高效液相色谱法测定结果准确且重现性好,可作为菌种复筛的测定方法。紫外分光光度法误差极大,改良的紫外分光光度法误差相对较小且快速简便,可作为菌种初筛的测定手段。以类球红细菌NM-FZ-47为出发菌株,采用紫外线和NTG两种诱变手段,利用筛选因子叠氮钠、对羟基苯甲酸、罗红霉素及卡那霉素对突变菌株进行推理选育构建辅酶Q10正突变库。选择较出发菌株提高15%且稳定性较好的突变株UV-LH-37、UV-NaN3-44、NTG-LH-28、NTG-NaN3-17、NTG-PHB-54、 NTG-LN-67作为第一轮基因改组的出发菌株。类球红细菌原生质体制备与再生的研究结果表明:菌龄18h、溶菌酶浓度为0.75mg/mL.酶解时间30min、酶解温度35℃、0.6mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,此条件下制备率和再生率分别为92.1%和25.1%。类球红细菌原生质体融合条件研究结果表明:采用灭活法标记,紫外线处理时间为10mim、60℃水浴处理8min,原生质体灭活率可以达到100%;原生质体融合的最佳条件:35%PEG6000、Ca2+0.01mol/L、融合温度30℃、融合时间5min,融合率达到9.1×10-3。基因组改组选育过程中,通过3轮递推式融合选育出一株遗传稳定的重组子F3-40,其辅酶Q1o产量为118.26mg/L,较出发菌株NM-FZ-47提高了86.52%。对F3-40进行发酵优化,最佳发酵条件为:接种量为15%,初始pH为6.4,装液量40mL/250mL三角瓶;培养基中最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为酵母粉;通过Plackett-Burman实验设计对培养基中9个因子进行筛选,获得3个重要影响成分:葡萄糖、谷氨酸和氯化铵。再利用响应面法对这三个组分进行3水平优化,得到最佳组合:谷氨酸6.98g/L、氯化铵5.15g/L、葡萄糖24.05g/L,在这个组合下,实验值为213.25mg/L,比优化前提高了80.32%,比出发菌株提高了236.75%。
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