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摘要：建立了公英青蓝合剂中非法添加金刚乙胺检测的UPLC - MS/MS方法。样品经甲醇提取稀释后，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱为分离柱，质谱正离子扫描分析测定。结果显示，金刚乙胺在0.5-50ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.9985）;样品检出限为2μg/mL，定量限为5μg/mL;在5、25、50、100μg/mL添加水平的回收率为90%～110%，批内批间变异系数均小于10%。本方法灵敏、快速、重现性好，适用于公英青蓝合剂中非法添加金刚乙胺的检测。
关键词：金刚乙胺;公英青蓝合剂;超高效液相一串联质谱法
Determination of Rimantadine Illegally Added inGongying Qinglan Mixture by UPLC-MS/MS Wei Xiuli， Zhang Zhimin， Zhao Youxuan， Zhang Chuanjin， Li Youzhi
Abstract
A method was established for determination of rimantadine added in Gongying Qinglan Mixtureby UPLC - MS/MS. The sample was extracted and diluted with methanol， the ACQUITY UPLCR BEH C18was used as the separation column， and the determination was conducted by scanning positive ion by massspectrometry. The results showed that the linear relationship of rimantadine was better in the range of 0.5 to50 ng/mL （ R2 =0.9985） . The detection limit was 2 μg/mL， and the quantitation limit was 5μg/mL. The a-nalysis of spiked 5， 25， 50， 100 μg/mL rimantadine showed that the recoveries ranged from 90% t0 110%and the relative standard deviations were below 10%. The experiment showed that the method was reliable，sensitive and reproducible and suitable for the determination of rimantadine illegally added in Gongying Qing-lan Mixture.
Keywords
Rimantadine; Gongying Qinglan Mixture; UPLC - MS/MS
公英青藍合剂[1]是由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩、黄渤、甘草、藿香、石膏九味药物组成的灭菌合剂，养禽业使用频率较高，具有清热解毒功效，用于禽类传染性法氏囊病等病毒病的辅助治疗。金刚乙胺在人医临床是一种抗病毒药物[2]，早些年养禽业临床兽医也使用它防治禽病毒病，但其耐药性日增且兽药残留对畜产品消费者存在较大风险。早在2005年农业部560号公告已经禁止金刚乙胺用于畜禽养殖业，12月又发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，美国食品药品监督管理局（FDA）也明令禁止在畜禽养殖业使用此类药物，禁止金刚烷胺、金刚乙胺抗病毒兽药的生产和使用，缘由是其作为抗病毒药物应用于兽医临床，缺乏科学规范、安全有效的试验数据。但少数不法兽药企业在利益的驱动下违规添加金刚乙胺，严重影响畜禽产品质量安全，而兽药典没有相应的检测方法。本实验室参考兽药残留的检测方法[3-6]，致力于兽药中多种非法添加物的检测[7，8]，研究建立公英青蓝合剂中非法添加物金刚乙胺的超高效液相串联质谱法检测方法，以期为非法添加金刚乙胺的定性、定量测定提供可靠手段。
1 材料与方法
1.1 仪器
分析天平：感量0.00001g，瑞士Mettler公司;Waters Quattro premier超高效液相一串联质谱仪、0.22μm滤膜均为Waters公司;离心机，日立。
1.2药品及试剂
金刚乙胺，批号100969 - 201101，含量100%，中国食品药品检定研究院。甲酸、甲醇均为色谱纯;超纯水。
1.3 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC⑧BEH C18色谱柱，50 mm x2.1mm×1.7μm;流动相A：甲醇（0.1%甲酸）;流动相B：水溶液（0.1%甲酸）;流速：0.3mL/min;进样量：10 μL;柱温：35℃。
液相色谱梯度洗脱程序见表1。
1.4 质谱条件
电喷雾离子源;正离子扫描（ESI+）;多反应监测（MRM）;离子源温度：11O℃;脱溶剂温度：320℃;脱溶剂氮气流速：500 L/h;毛细管电压：3 kV。
测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。
1.5 样品制备
1.5.1 阴性样品公英青蓝合剂，批号180216，来源：烟台绿叶动物保健有限公司;批号：20180201，来源：潍坊华英生物科技有限公司。
1.5.2 标准储备液的制备 精密称取金刚乙胺标准物质10mg（准确至0.01mg），置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。-20℃冰箱保存，贮存期3个月。 1.5.3 样品溶液的制备 精密量取空白公英青蓝合剂0.2mL，置50mL离心管中，加19.8mL甲醇，超声处理10 min，5000 r/min离心5 min，过滤，精密量取续滤液lmL，置50mL容量瓶中加初始流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，即得空白基质溶质。待测样品以上法处理，作为UPLC -MS/MS供试品溶液。
1.5.4 基质匹配标准储备溶液的制备 精密量取金刚乙胺标准储备液0.2mL，置20mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，从中精密量取1mL置10 mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得100ng/mL的基质匹配标准储备溶液。
1.5.5 标准曲线的绘制 上述储备液（1.5.2）用初始比例流动相稀释，制成0.5、l、2、5、10、20、40、50 ng/mL的溶液，并绘制标准曲线。
1.5.6 阳性添加样品的制备 精密称取5、10、20mg金刚乙胺分别加入到阴性样品基质200 mL中配制成25、50、100 μg/mL的阳性添加样品，旋涡混匀，每种添加浓度制备3份平行样，每份样品至少进样2次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 线性考察
在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离各离子。取标准曲线0.5、1、2、5、10、20、40、50 ng/mL的溶液，经高效液相色谱串联质谱仪测定后，以标准溶液中金刚乙胺定量离子峰面积为纵坐标，标准溶液中相应金刚乙胺的浓度为横坐标，绘制标准曲线（图1），在0.5～50ng/mL的范围内标准曲线方程为Y=1381.654X - 435.313，Y为金刚乙胺定量离子峰面积，X（ng/mL）为金刚乙胺的浓度，其相关系数R2为0.999，线性良好。
2.2 回收试验
公英青蓝合剂中添加金刚乙胺，液质分离良好，无干扰，公英青蓝合剂中添加浓度5、25、50、100μg/mL，批内批间变异系数均小于10%，阳性添加样品的回收率在80%～120%（表3）。
本方法批内相对标准偏差<10%，批间相对标准偏差<10%。
对照溶液、空白样品及阳性添加样品的液相色谱一串联质谱谱图见图2～图5。
3 讨论与结论
本研究中，金刚乙胺经甲醇超声提取，稀释过滤后，取上清液，用UPLC分离，串联质谱检测，外标法定量，成功建立了公英青蓝合剂中非法添加的金刚乙胺检测方法。该方法经过验证，灵敏度、准确性、精密度高，检测限低，时间短，速度快，适用于公英青蓝合剂中金刚乙胺非法添加的定性、定量检测。
3.1 本试验分别选择甲醇（0.1%甲酸）和乙腈（0.1%甲酸）为流动相A作比较，发现以甲醇为流动相，其特征离子质量色谱图的峰形和分离度比用乙腈做流动相好，最终选择甲醇（0.1%甲酸）为流动相A。
3.2 本方法選择多反应监测模式、正离子扫描，并不断优化质谱条件：对离子源温度、脱溶剂气流量、锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使药物的离子化程度达到最佳状态。计算结果采用外标法，标准曲线线性良好;样品经过1000倍的稀释，上机检测杂峰极微，无干扰，分离度好。
3.3 本试验针对公英青蓝合剂中非法添加的金刚乙胺，进行了方法学的考察验证，回收率高，准确度、精密度良好。下一步需要研究其他中兽药单方或复方制剂的金刚乙胺的检测方法，为进一步制订国家标准提供依据，为治理整顿兽药中添加违禁药物、严厉打击违法行为提供检测方法。
参考文献：
[1] 中国兽药典委员会.兽药质量标准（中药卷）[M].北京：中国农业出版社，2017：96 - 97.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：1020.
[3] 齐刚，张秀芹，刘婷，等.超高效液相色谱串联质谱法检测鸡蛋中的金刚烷胺和金刚乙胺[J].现代畜牧科技，2017 （1）：4-5.7.
[4] 尹晖，孙雷，毕言锋，等.鸡肉和鸡蛋中金刚烷胺与金刚乙胺残留检测UPLC - MS/MS法研究[J].中国兽药杂志，2014，48（6）：32 -35.
[5] 陈慧华，韦敏珏，周炜，等.液相色谱一串联质谱法测定动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺的残留量[J].质谱学报，2013，34（4）：226 -232.
[6] 段科，刘刚，娄喜山，等.超高效液相色谱一串联质谱法测定动物组织中的金刚烷胺、金刚乙胺和盐酸美金刚[J].食品安全质量检测学报，2018，9（3）：652 -658.
[7] 魏秀丽，张传津，李有志.UPLC - PDA法测定杨树花口服液中非法添加物黄芩苷[J].中国兽药杂志，2018，52（1）：50 -55.
[8] 魏秀丽，高迎春，杨林，等.超高效液相一串联质谱法检测抗菌药物中非法添加物利巴韦林[C]∥中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016年学术年会论文集.
关键词：金刚乙胺;公英青蓝合剂;超高效液相一串联质谱法
Determination of Rimantadine Illegally Added inGongying Qinglan Mixture by UPLC-MS/MS Wei Xiuli， Zhang Zhimin， Zhao Youxuan， Zhang Chuanjin， Li Youzhi
Abstract
A method was established for determination of rimantadine added in Gongying Qinglan Mixtureby UPLC - MS/MS. The sample was extracted and diluted with methanol， the ACQUITY UPLCR BEH C18was used as the separation column， and the determination was conducted by scanning positive ion by massspectrometry. The results showed that the linear relationship of rimantadine was better in the range of 0.5 to50 ng/mL （ R2 =0.9985） . The detection limit was 2 μg/mL， and the quantitation limit was 5μg/mL. The a-nalysis of spiked 5， 25， 50， 100 μg/mL rimantadine showed that the recoveries ranged from 90% t0 110%and the relative standard deviations were below 10%. The experiment showed that the method was reliable，sensitive and reproducible and suitable for the determination of rimantadine illegally added in Gongying Qing-lan Mixture.
Keywords
Rimantadine; Gongying Qinglan Mixture; UPLC - MS/MS
公英青藍合剂[1]是由蒲公英、大青叶、板蓝根、金银花、黄芩、黄渤、甘草、藿香、石膏九味药物组成的灭菌合剂，养禽业使用频率较高，具有清热解毒功效，用于禽类传染性法氏囊病等病毒病的辅助治疗。金刚乙胺在人医临床是一种抗病毒药物[2]，早些年养禽业临床兽医也使用它防治禽病毒病，但其耐药性日增且兽药残留对畜产品消费者存在较大风险。早在2005年农业部560号公告已经禁止金刚乙胺用于畜禽养殖业，12月又发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，美国食品药品监督管理局（FDA）也明令禁止在畜禽养殖业使用此类药物，禁止金刚烷胺、金刚乙胺抗病毒兽药的生产和使用，缘由是其作为抗病毒药物应用于兽医临床，缺乏科学规范、安全有效的试验数据。但少数不法兽药企业在利益的驱动下违规添加金刚乙胺，严重影响畜禽产品质量安全，而兽药典没有相应的检测方法。本实验室参考兽药残留的检测方法[3-6]，致力于兽药中多种非法添加物的检测[7，8]，研究建立公英青蓝合剂中非法添加物金刚乙胺的超高效液相串联质谱法检测方法，以期为非法添加金刚乙胺的定性、定量测定提供可靠手段。
1 材料与方法
1.1 仪器
分析天平：感量0.00001g，瑞士Mettler公司;Waters Quattro premier超高效液相一串联质谱仪、0.22μm滤膜均为Waters公司;离心机，日立。
1.2药品及试剂
金刚乙胺，批号100969 - 201101，含量100%，中国食品药品检定研究院。甲酸、甲醇均为色谱纯;超纯水。
1.3 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC⑧BEH C18色谱柱，50 mm x2.1mm×1.7μm;流动相A：甲醇（0.1%甲酸）;流动相B：水溶液（0.1%甲酸）;流速：0.3mL/min;进样量：10 μL;柱温：35℃。
液相色谱梯度洗脱程序见表1。
1.4 质谱条件
电喷雾离子源;正离子扫描（ESI+）;多反应监测（MRM）;离子源温度：11O℃;脱溶剂温度：320℃;脱溶剂氮气流速：500 L/h;毛细管电压：3 kV。
测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。
1.5 样品制备
1.5.1 阴性样品公英青蓝合剂，批号180216，来源：烟台绿叶动物保健有限公司;批号：20180201，来源：潍坊华英生物科技有限公司。
1.5.2 标准储备液的制备 精密称取金刚乙胺标准物质10mg（准确至0.01mg），置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。-20℃冰箱保存，贮存期3个月。 1.5.3 样品溶液的制备 精密量取空白公英青蓝合剂0.2mL，置50mL离心管中，加19.8mL甲醇，超声处理10 min，5000 r/min离心5 min，过滤，精密量取续滤液lmL，置50mL容量瓶中加初始流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，即得空白基质溶质。待测样品以上法处理，作为UPLC -MS/MS供试品溶液。
1.5.4 基质匹配标准储备溶液的制备 精密量取金刚乙胺标准储备液0.2mL，置20mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，从中精密量取1mL置10 mL容量瓶中，加空白基质溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得100ng/mL的基质匹配标准储备溶液。
1.5.5 标准曲线的绘制 上述储备液（1.5.2）用初始比例流动相稀释，制成0.5、l、2、5、10、20、40、50 ng/mL的溶液，并绘制标准曲线。
1.5.6 阳性添加样品的制备 精密称取5、10、20mg金刚乙胺分别加入到阴性样品基质200 mL中配制成25、50、100 μg/mL的阳性添加样品，旋涡混匀，每种添加浓度制备3份平行样，每份样品至少进样2次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 线性考察
在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离各离子。取标准曲线0.5、1、2、5、10、20、40、50 ng/mL的溶液，经高效液相色谱串联质谱仪测定后，以标准溶液中金刚乙胺定量离子峰面积为纵坐标，标准溶液中相应金刚乙胺的浓度为横坐标，绘制标准曲线（图1），在0.5～50ng/mL的范围内标准曲线方程为Y=1381.654X - 435.313，Y为金刚乙胺定量离子峰面积，X（ng/mL）为金刚乙胺的浓度，其相关系数R2为0.999，线性良好。
2.2 回收试验
公英青蓝合剂中添加金刚乙胺，液质分离良好，无干扰，公英青蓝合剂中添加浓度5、25、50、100μg/mL，批内批间变异系数均小于10%，阳性添加样品的回收率在80%～120%（表3）。
本方法批内相对标准偏差<10%，批间相对标准偏差<10%。
对照溶液、空白样品及阳性添加样品的液相色谱一串联质谱谱图见图2～图5。
3 讨论与结论
本研究中，金刚乙胺经甲醇超声提取，稀释过滤后，取上清液，用UPLC分离，串联质谱检测，外标法定量，成功建立了公英青蓝合剂中非法添加的金刚乙胺检测方法。该方法经过验证，灵敏度、准确性、精密度高，检测限低，时间短，速度快，适用于公英青蓝合剂中金刚乙胺非法添加的定性、定量检测。
3.1 本试验分别选择甲醇（0.1%甲酸）和乙腈（0.1%甲酸）为流动相A作比较，发现以甲醇为流动相，其特征离子质量色谱图的峰形和分离度比用乙腈做流动相好，最终选择甲醇（0.1%甲酸）为流动相A。
3.2 本方法選择多反应监测模式、正离子扫描，并不断优化质谱条件：对离子源温度、脱溶剂气流量、锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使药物的离子化程度达到最佳状态。计算结果采用外标法，标准曲线线性良好;样品经过1000倍的稀释，上机检测杂峰极微，无干扰，分离度好。
3.3 本试验针对公英青蓝合剂中非法添加的金刚乙胺，进行了方法学的考察验证，回收率高，准确度、精密度良好。下一步需要研究其他中兽药单方或复方制剂的金刚乙胺的检测方法，为进一步制订国家标准提供依据，为治理整顿兽药中添加违禁药物、严厉打击违法行为提供检测方法。
参考文献：
[1] 中国兽药典委员会.兽药质量标准（中药卷）[M].北京：中国农业出版社，2017：96 - 97.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：1020.
[3] 齐刚，张秀芹，刘婷，等.超高效液相色谱串联质谱法检测鸡蛋中的金刚烷胺和金刚乙胺[J].现代畜牧科技，2017 （1）：4-5.7.
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[5] 陈慧华，韦敏珏，周炜，等.液相色谱一串联质谱法测定动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺的残留量[J].质谱学报，2013，34（4）：226 -232.
[6] 段科，刘刚，娄喜山，等.超高效液相色谱一串联质谱法测定动物组织中的金刚烷胺、金刚乙胺和盐酸美金刚[J].食品安全质量检测学报，2018，9（3）：652 -658.
[7] 魏秀丽，张传津，李有志.UPLC - PDA法测定杨树花口服液中非法添加物黄芩苷[J].中国兽药杂志，2018，52（1）：50 -55.
[8] 魏秀丽，高迎春，杨林，等.超高效液相一串联质谱法检测抗菌药物中非法添加物利巴韦林[C]∥中国畜牧兽医学会动物药品学分会第五届全国会员代表大会暨2016年学术年会论文集.