【摘 要】
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本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57B
【机 构】
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徐州市儿童医院感染科,徐州医学院附属医院血液科
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本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到108TU/ml。以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95%,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白。结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。
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