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摘要：目的： 探讨胶质瘤干细胞在胶质瘤的生成和复发过程中的作用。方法： 在本研究中我们通过体内和体外实验证实三氧化二砷（As2O3）对胶质瘤干细胞具有抑制作用，利用免疫荧光技术和流式细胞技术，检测三个胶质瘤细胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3处理72h后Nestin蛋白表达变化；利用软胶悬浮培养技术检测肿瘤细胞系神经球形成变化；利用免疫缺陷鼠检测肿瘤移植物生成變化；利用Western印记分析检测肿瘤细胞系Notch1和Hes1蛋白表达变化。结果： As2O3（2μM）能将胶质瘤细胞系U87MG、U251MG和U373MG中的胶质瘤干细胞分别减少12%、14%和7%，抑制肿瘤移植物在免疫缺陷鼠中生成和U87MG细胞系生成神经球，通过免疫印迹分析我们发现伴随胶质瘤干细胞的抑制Notch1和Hes1蛋白减少。结论： As2O3对胶质瘤干细胞具有明显的抑制作用，其机制为Notch途径活性的下调。
关键词：胶质瘤；癌干细胞；三氧化二砷
胶质瘤对放化疗具有抵制作用，所以极易复发。然而，通过对治疗抵制机制的研究，一小群胶质瘤干细胞在此过程中发挥重要作用，从而使胶质瘤的复发率明显下降[1，2]。全新的针对胶质瘤干细胞的治疗方案受到广泛关注。尽管最近一些报道称胶质瘤干细胞对放化疗具有抵制作用，但是，通过对信号途径的调节一些药物已经表现出对胶质瘤干细胞具有抑制作用[3，4]。例如，cyclopamine通过阻断Hedgehog信号通路能减少胶质瘤干细胞[5]。
在本研究中我们检测了As2O3抑制胶质瘤干细胞的作用。我们的结论是低剂量的As2O3即能抑制胶质瘤干细胞增殖。同时，我们也分析了可能的机制，发现Notch信号通路的下调是As2O3抑制胶质瘤干细胞增殖的重要机制。我们的数据证实As2O3通过下调Notch信号通路能抑制胶质瘤干细胞的增殖。
材料和方法
1.药物
As2O3来自哈尔滨医科大学附属第一医院药剂科，应用PBS将As2O3稀释成五个不同浓度（1，2，4，8和16μM）用于体内和体外实验。
2.细胞培养
U87MG，U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系被培养在含10%胎牛血清的DMEM中。利用细胞计数系统（CT02，CHEMICON）检测As2O3对细胞增殖的抑制效果。使用MTT法对细胞增殖分析进行评估[20]。简单地说，每孔含有100μl培养基的96孔板中加入1×104个细胞，培养4h后加入各种浓度的As2O3，然后培养24-72h吸除培养液加入WST-8（四唑氮盐），在37℃条件下培养30分钟后，应用分光光度仪在570nm波长下测量每个孔的吸光光度值，吸光光度值与细胞数量相对应并不受As2O3的影响，以对照孔为基础计算细胞的增值率，绘制剂量依赖性曲线和计算半数致死剂量，实验被重复三次。
3.流式细胞仪
三个胶质瘤细胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3处理72h后，应用Nestin-FITC抗体（R&D System），根据产品说明书做染色，染色后的细胞应用FACS （BD Cor.）进行分析，数据用WinMDI 2.87分析，结果应用ModFit LT 3.1（Verity）证实。
4.免疫荧光染色
培养细胞经2μM和4μM As2O3 处理72h后，应用4%的多聚甲醛固定15分钟，0.2% Triton X-100透化10分钟，蛋白阻断剂（Thermo）培养5分钟，1：200稀释的Nestin 单克隆抗体（MAB5326， CHEMICON）4℃过夜，1：20稀释的FITC二抗（DakoCytomation） 室温1h，最后应用DAPI（Sigma）染色，被标记的细胞应用共聚焦显微镜分析。
在凋亡的实验中细胞被2μM和4μM As2O3 处理24h，应用鼠的Nestin单克隆抗体（CHEMICON）和兔的Caspase-3多克隆抗体（CHEMICON），二抗分别为FITC （CHEMICON） 和PE（Sigma）。
结 果
1. As2O3抑制胶质瘤细胞的增殖
为了确定As2O3是否能抑制胶质瘤细胞增殖，我们检测了它对U87MG、U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系抑制效果。这些细胞被1、2、4、8和16μM As2O3处理72h，应用MTT法揭示了As2O3的剂量依赖性抑制效果。依据细胞系的不同其对As2O3的敏感度也不同，半数致死剂量分别为1.9、2.4和3.0μM（Fig.1）。这些结果展示了As2O3能在体外有效地抑制这三种细胞的增殖，接近半数致死剂量（2μM和4μM）的As2O3被用于余下的实验。
2.As2O3能减少Nestin（+）胶质瘤细胞的百分率
在U87MG、U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系中，Nestin（+）细胞的百分率分别为89%、88%和98%（Fig.2）。根据流式细胞仪和免疫染色的结果，经不同浓度As2O3（2、4、8和16μM ）处理后Nestin（+）肿瘤细胞的百分率明显下降。代表胶质瘤干细Nestin（+）细胞在U87MG肿瘤细胞系中由89%分别下降到78%（2μM ）和68%（4μM），同样，U251MG由88%下降到76%和64%，U373MG由98%下降到91%和58%。这些结果都说明，在这三个胶质瘤细胞系中As2O3能减少Nestin（+）肿瘤细胞，也就是说As2O3能抑制这三个胶质瘤细胞系的增殖，这些结果也促使我去探寻As2O3抑制胶质瘤干细胞的机制。
3.神经球形成分析
接下来我们检测了As2O3在体外抑制肿瘤生成的效果。首先，通过克隆形成分析我们检测了U87MG是否能形成孤立的神经克隆，然后，将U87MG细胞喂养在含软胶培养皿中，平均每个视野下可形成41个神经克隆（Fig.3），同样数量经2μM和4μMAs2O3处理后的活细胞在同样软胶培养条件下，形成神经克隆的数量分别为21个和5个，8μM As2O3能更加明显地减少神经克隆的形成。 4.肿瘤移植物形成分析
为了确定As2O3对肿瘤移植物形成的影响，三个胶质瘤细胞系（U87MG、U251MG和U373MG）被As2O3（2μM和4μM）处理72h后，应用台盼蓝染色计数有活力的细胞，每组50万个有活力的细胞被注入裸鼠皮下，再对照側有大的肿瘤移植物形成，相反，在处理组侧仅有较小或没有肿瘤移植物形成（Fig.4）。这些结果说明U87MG、U251MG和U373MG细胞的肿瘤形成能力可被低浓度的As2O3所抑制。
讨 论
最近，与肿瘤起源和生存相关的癌症干细胞被认为是肿瘤的发生和复发的重要原因[2]。而且，一些报道称这些细胞对传统的放化疗具有抵制作用[3，4]。因此，寻找有效的治疗策略成为研究的热点。低剂量的As2O3能使急性早幼粒细胞白血病患者得到完全缓解[15]，抑制APL干细胞增殖[17]，所以，As2O3被认为能去除APL中的癌症干细胞。然而，As2O3是否能去除胶质瘤中的癌症干细胞仍是未知。在本研究中我们检测了As2O3对U87MG、U251MG和U373MG三种胶质瘤细胞系的胶质瘤干细胞的抑制效果，发现，在体外低剂量的As2O3能抑制Nestin（+）细胞的增殖，而且，能明显抑制肿瘤克隆的形成，同时有效地抑制肿瘤移植物在裸鼠体内的形成。本实验第一次说明了As2O3能抑制胶质瘤细胞系中的癌症干细胞。同时，我们观察到经As2O3处理的肿瘤细胞中Notch1和Hes1蛋白明显下降，说明Notch信号通路的下调参与了As2O3对胶质瘤干细胞的抑制过程，这些结果都说明As2O3能克服化疗抵制对胶质瘤干细胞发挥抑制作用。
在体内和体外低浓度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG细胞的增殖说明，此药物可以被考虑进行进一步的动物实验，以能真正用于临床治疗胶质瘤患者。而且，本研究第一次说明了As2O3诱导胶质瘤干细胞抑制的机制。下一步实验我们将证实其它机制的存在，例如Notch信号通路与其它信号通路之间的相互作用以及As2O3诱导的自噬。
总之，As2O3诱导的Notch信号通路阻滞抑制了胶质瘤干细胞的增殖，因此，As2O3能有效地抑制胶质瘤的生长。这个结论为进一步研究As2O3在临床上治疗胶质瘤提供了理论基础。
参考文献：
[1] P.B. Dirks， Cancer stem cells and brain tumours， Nature 444 （2006）687688.
[2] X. Yuan， J. Curtin， Y. Xiong， G. Liu， S. Waschsmann-Hogiu， D.L. Farkas， K.L. Black， J.S. Yu， Isolation of cancer stem cells from adult glioblastoma multiforme， Oncogene 23 （2004） 9392–9400.
[3] S.D. Bao， Q.L. Wu， R.E. McLendon， Y.L. Hao， Q. Shi， A.B. Hjelmeland， M.W. Dewhirst， D.D. Bigner， J.N. Rich， Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response， Nature 444 （2006） 756–760.
[4] A.J. Ghods， D. Irvin， G. Liu， X. Yuan， I.R. Abdulkadir， P. Tunici， B.Konda， S. Wachsmann-Hogiu， K.L. Black， J.S. Yu， Spheres isolated from 9L gliosarcoma rat cell line possess chemoresistant and aggressive cancer stem-like cells， Stem Cells 25 （2007） 1645–1653.
关键词：胶质瘤；癌干细胞；三氧化二砷
胶质瘤对放化疗具有抵制作用，所以极易复发。然而，通过对治疗抵制机制的研究，一小群胶质瘤干细胞在此过程中发挥重要作用，从而使胶质瘤的复发率明显下降[1，2]。全新的针对胶质瘤干细胞的治疗方案受到广泛关注。尽管最近一些报道称胶质瘤干细胞对放化疗具有抵制作用，但是，通过对信号途径的调节一些药物已经表现出对胶质瘤干细胞具有抑制作用[3，4]。例如，cyclopamine通过阻断Hedgehog信号通路能减少胶质瘤干细胞[5]。
在本研究中我们检测了As2O3抑制胶质瘤干细胞的作用。我们的结论是低剂量的As2O3即能抑制胶质瘤干细胞增殖。同时，我们也分析了可能的机制，发现Notch信号通路的下调是As2O3抑制胶质瘤干细胞增殖的重要机制。我们的数据证实As2O3通过下调Notch信号通路能抑制胶质瘤干细胞的增殖。
材料和方法
1.药物
As2O3来自哈尔滨医科大学附属第一医院药剂科，应用PBS将As2O3稀释成五个不同浓度（1，2，4，8和16μM）用于体内和体外实验。
2.细胞培养
U87MG，U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系被培养在含10%胎牛血清的DMEM中。利用细胞计数系统（CT02，CHEMICON）检测As2O3对细胞增殖的抑制效果。使用MTT法对细胞增殖分析进行评估[20]。简单地说，每孔含有100μl培养基的96孔板中加入1×104个细胞，培养4h后加入各种浓度的As2O3，然后培养24-72h吸除培养液加入WST-8（四唑氮盐），在37℃条件下培养30分钟后，应用分光光度仪在570nm波长下测量每个孔的吸光光度值，吸光光度值与细胞数量相对应并不受As2O3的影响，以对照孔为基础计算细胞的增值率，绘制剂量依赖性曲线和计算半数致死剂量，实验被重复三次。
3.流式细胞仪
三个胶质瘤细胞系（U87MG，U251MG和U373MG）被As2O3处理72h后，应用Nestin-FITC抗体（R&D System），根据产品说明书做染色，染色后的细胞应用FACS （BD Cor.）进行分析，数据用WinMDI 2.87分析，结果应用ModFit LT 3.1（Verity）证实。
4.免疫荧光染色
培养细胞经2μM和4μM As2O3 处理72h后，应用4%的多聚甲醛固定15分钟，0.2% Triton X-100透化10分钟，蛋白阻断剂（Thermo）培养5分钟，1：200稀释的Nestin 单克隆抗体（MAB5326， CHEMICON）4℃过夜，1：20稀释的FITC二抗（DakoCytomation） 室温1h，最后应用DAPI（Sigma）染色，被标记的细胞应用共聚焦显微镜分析。
在凋亡的实验中细胞被2μM和4μM As2O3 处理24h，应用鼠的Nestin单克隆抗体（CHEMICON）和兔的Caspase-3多克隆抗体（CHEMICON），二抗分别为FITC （CHEMICON） 和PE（Sigma）。
结 果
1. As2O3抑制胶质瘤细胞的增殖
为了确定As2O3是否能抑制胶质瘤细胞增殖，我们检测了它对U87MG、U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系抑制效果。这些细胞被1、2、4、8和16μM As2O3处理72h，应用MTT法揭示了As2O3的剂量依赖性抑制效果。依据细胞系的不同其对As2O3的敏感度也不同，半数致死剂量分别为1.9、2.4和3.0μM（Fig.1）。这些结果展示了As2O3能在体外有效地抑制这三种细胞的增殖，接近半数致死剂量（2μM和4μM）的As2O3被用于余下的实验。
2.As2O3能减少Nestin（+）胶质瘤细胞的百分率
在U87MG、U251MG和U373MG三个胶质瘤细胞系中，Nestin（+）细胞的百分率分别为89%、88%和98%（Fig.2）。根据流式细胞仪和免疫染色的结果，经不同浓度As2O3（2、4、8和16μM ）处理后Nestin（+）肿瘤细胞的百分率明显下降。代表胶质瘤干细Nestin（+）细胞在U87MG肿瘤细胞系中由89%分别下降到78%（2μM ）和68%（4μM），同样，U251MG由88%下降到76%和64%，U373MG由98%下降到91%和58%。这些结果都说明，在这三个胶质瘤细胞系中As2O3能减少Nestin（+）肿瘤细胞，也就是说As2O3能抑制这三个胶质瘤细胞系的增殖，这些结果也促使我去探寻As2O3抑制胶质瘤干细胞的机制。
3.神经球形成分析
接下来我们检测了As2O3在体外抑制肿瘤生成的效果。首先，通过克隆形成分析我们检测了U87MG是否能形成孤立的神经克隆，然后，将U87MG细胞喂养在含软胶培养皿中，平均每个视野下可形成41个神经克隆（Fig.3），同样数量经2μM和4μMAs2O3处理后的活细胞在同样软胶培养条件下，形成神经克隆的数量分别为21个和5个，8μM As2O3能更加明显地减少神经克隆的形成。 4.肿瘤移植物形成分析
为了确定As2O3对肿瘤移植物形成的影响，三个胶质瘤细胞系（U87MG、U251MG和U373MG）被As2O3（2μM和4μM）处理72h后，应用台盼蓝染色计数有活力的细胞，每组50万个有活力的细胞被注入裸鼠皮下，再对照側有大的肿瘤移植物形成，相反，在处理组侧仅有较小或没有肿瘤移植物形成（Fig.4）。这些结果说明U87MG、U251MG和U373MG细胞的肿瘤形成能力可被低浓度的As2O3所抑制。
讨 论
最近，与肿瘤起源和生存相关的癌症干细胞被认为是肿瘤的发生和复发的重要原因[2]。而且，一些报道称这些细胞对传统的放化疗具有抵制作用[3，4]。因此，寻找有效的治疗策略成为研究的热点。低剂量的As2O3能使急性早幼粒细胞白血病患者得到完全缓解[15]，抑制APL干细胞增殖[17]，所以，As2O3被认为能去除APL中的癌症干细胞。然而，As2O3是否能去除胶质瘤中的癌症干细胞仍是未知。在本研究中我们检测了As2O3对U87MG、U251MG和U373MG三种胶质瘤细胞系的胶质瘤干细胞的抑制效果，发现，在体外低剂量的As2O3能抑制Nestin（+）细胞的增殖，而且，能明显抑制肿瘤克隆的形成，同时有效地抑制肿瘤移植物在裸鼠体内的形成。本实验第一次说明了As2O3能抑制胶质瘤细胞系中的癌症干细胞。同时，我们观察到经As2O3处理的肿瘤细胞中Notch1和Hes1蛋白明显下降，说明Notch信号通路的下调参与了As2O3对胶质瘤干细胞的抑制过程，这些结果都说明As2O3能克服化疗抵制对胶质瘤干细胞发挥抑制作用。
在体内和体外低浓度的As2O3都能抑制U87MG、U251MG和U373MG细胞的增殖说明，此药物可以被考虑进行进一步的动物实验，以能真正用于临床治疗胶质瘤患者。而且，本研究第一次说明了As2O3诱导胶质瘤干细胞抑制的机制。下一步实验我们将证实其它机制的存在，例如Notch信号通路与其它信号通路之间的相互作用以及As2O3诱导的自噬。
总之，As2O3诱导的Notch信号通路阻滞抑制了胶质瘤干细胞的增殖，因此，As2O3能有效地抑制胶质瘤的生长。这个结论为进一步研究As2O3在临床上治疗胶质瘤提供了理论基础。
参考文献：
[1] P.B. Dirks， Cancer stem cells and brain tumours， Nature 444 （2006）687688.
[2] X. Yuan， J. Curtin， Y. Xiong， G. Liu， S. Waschsmann-Hogiu， D.L. Farkas， K.L. Black， J.S. Yu， Isolation of cancer stem cells from adult glioblastoma multiforme， Oncogene 23 （2004） 9392–9400.
[3] S.D. Bao， Q.L. Wu， R.E. McLendon， Y.L. Hao， Q. Shi， A.B. Hjelmeland， M.W. Dewhirst， D.D. Bigner， J.N. Rich， Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response， Nature 444 （2006） 756–760.
[4] A.J. Ghods， D. Irvin， G. Liu， X. Yuan， I.R. Abdulkadir， P. Tunici， B.Konda， S. Wachsmann-Hogiu， K.L. Black， J.S. Yu， Spheres isolated from 9L gliosarcoma rat cell line possess chemoresistant and aggressive cancer stem-like cells， Stem Cells 25 （2007） 1645–1653.