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摘要
辣椒黄脉病毒（Pepper vein yellows virus，PeVYV）是影响世界辣椒生产的重要病毒，也是广东省辣椒上主要病原病毒之一。本研究根据PeVYV基因组P3蛋白基因序列设计了2对引物，建立了该病毒的反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RTLAMP）检测方法。该方法70 min便可完成对PeVYV的检测，无需特殊的设备，灵敏度比普通RTPCR高10倍，对田间疑似病样的检出结果与RTPCR的结果一致。本研究建立的PeVYV RTLAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点，适合于对PeVYV病样快速、准确检测与鉴定。
关键词
辣椒黄脉病毒；RTLAMP；快速检测
中图分类号：
S 436.418
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.017
Abstract
Pepper vein yellows virus （PeVYV） is an important virus of pepper worldwide. It is also one of the main pathogenic viruses infecting pepper in Guangdong Province. By using primer explorer software， two pairs of primers were designed according to the P3 gene sequence of PeVYV.The reverse transcription loopmediated isothermal amplification （RTLAMP） detection method of PeVYV was developed. The PeVYV detection could be finished within 70 min by using this method and needs no special equipment. Its sensitivity was 10 times higher than that of ordinary RTPCR.The detection result of suspected samples collected from fields by the method was consistent with that by RTPCR.The advantages of RTLAMP detection method for PeVYV were rapid， sensitive and simple. Hence，the method is suitable for rapid and accurate detection and identification of PeVYV.
Key words
Pepper vein yellows virus；RTLAMP；rapid detection
辣椒黄脉病毒（Pepper vein yellows virus，PeVYV）属黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）成员，由蚜虫以持久方式传播，也可以嫁接传播[1]。该病毒在日本[12]、西班牙[3]、突尼斯、土耳其[4]、印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国[5]、苏丹[6]和美国[7]等国家均有分布。我国的台湾[5]、湖南[8]和山东[9]等省也先后报道了该病毒。辣椒感染黄脉病毒后主要表现为叶脉黄化、叶片卷曲、节间缩短等，其产量和品质受到严重影响。
建立快速、灵敏和特异的检测鉴定方法是植物病毒病诊断、防治和预测预报的前提与基础。目前，PeVYV的检测主要采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）[6，9]。相对于血清学检测方法，该方法较快速（6 h左右）、灵敏和特异，但需要高精度的PCR仪及较复杂的方法来检测扩增产物，使其在日常诊断中受到限制。日本学者Notomi等开发了一种新型的核酸扩增方法——环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技术[10]。该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区域，利用DNA 链置换聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下对靶基因扩增。RTLAMP 方法是在LAMP 方法的基础上添加了反转录酶（AMV），使反转录和扩增在同一温度下进行。相对RTPCR来说，该技术更加简便、快速（70 min左右）、特异。该技术已被应用于番茄[1112]、柑橘[1314]、香蕉[15]、水稻[1617]、小麦[18]、马铃薯[1921]、草莓[22]、兰花[23]等多种作物的病毒病检测。本文以PeVYV的P3蛋白基因序列为靶标基因，设计了4 条特异性引物，建立了该病毒的RTLAMP快速检测方法。
1材料与方法
1.1材料
感染PeVYV的辣椒病样：采自广东茂名市辣椒产区，经RTPCR检测验证，置于-80℃保存；健康辣椒材料：本实验室在防虫温室中培育的健康辣椒叶片；待检材料：采自广东省各辣椒产区疑似辣椒病叶。
Loopamp RNA 扩增反应试剂盒、Loopamp FD 荧光检测试剂购自日本Eiken Chemical 公司；RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；一步法RTPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；LA320C 实时浊度仪由日本Eiken Chemical 公司提供。 1.2方法
1.2.1引物设计
依据GenBank中已登录的PeVYV基因组（GenBank序列登录号：AB594828.1、KP326573.1）的P3蛋白基因序列，应用LAMP 引物设计软件Primer Explorer V4 （http：∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计外侧引物对F3和B3以及内侧引物对FIP和BIP，将引物在NCBI数据库中PrimerBLAST模块下进行比对验证，最终选出用于RTLAMP的引物组合（表1）。应用PCR引物设计网站（http：∥primer3.ut.ee/），设计目的片段为562 bp的特异引物对PF/PR（表1）用于PeVYV的RTPCR检测。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2总RNA的提取
取辣椒病叶100 mg，应用RNA提取试剂盒抽提其总 RNA，根据试剂盒说明书的步骤进行操作，最终RNA沉淀溶解于40 μL DEPC处理的ddH2O中。
1.2.3RTLAMP反应体系及最佳反应温度
按照Loopamp RNA 扩增试剂盒的说明配制RTLAMP反应体系，即：2×反应缓冲液12.5 μL，酶溶液1.0 μL，40 pmol/μL引物FIP 1.0 μL，40 pmol/μL引物BIP 1.0 μL，10 pmol/μL引物F3 0.5 μL，10 pmol/μL引物B3 0.5 μL，荧光目视检测试剂1.0 μL，RNA模板10 μL，去离子水6.5 μL，反应总体系为25 μL。反应温度分别设为59℃、61℃、63℃ 和65℃，反应时间为60 min，之后加热至80℃ 5 min使酶失活。扩增反应在实时浊度仪上进行，根据60 min 内出现扩增曲线的最短时间确定最佳反应温度。反应结束后，根据反应液颜色进行判断，若显绿色，则为阳性反应；若显橙色，则判断为阴性反应。进一步通过电泳加以验证，取2 μL扩增产物，在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上100～125 V恒压电泳30 min，然后在紫外检测仪下观察。
1.2.4RTPCR
RTPCR反应参照一步法RTPCR试剂盒说明操作，即：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）25.0 μL，10 μmol/L 引物PF 2.0 μL，10 μmol/L 引物PR 2.0 μL，RNA模板1.0 μL，去离子水18 μL，总体系为50 μL。反应条件为：50℃反转录30 min；94℃预变性4 min，94℃变性30 min、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环，72℃最终延伸10 min，取 8 μL扩增产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上100～125 V恒压电泳30 min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
1.2.5灵敏度试验
将所提取的辣椒病叶片组织的总RNA按10-1～10-8进行浓度梯度稀释，以不同浓度的RNA作模板，分别进行RTLAMP和普通RTPCR检测，比较两者的检测灵敏度。
1.2.6PeVYV田间疑似病样RTLAMP检测
从广东省各辣椒产区采集疑似感染PeVYV的辣椒病样6份，提取总RNA，分别用1.2.3的RTLAMP方法检测，并用RTPCR 方法加以验证。
2结果与分析
2.1RTLAMP最佳反应温度
以感染PeVYV辣椒病叶组织的总RNA为模板，进行RTLAMP反应，实时浊度仪输出的扩增时间曲线（图1）表明：在59、61、63 和65℃的反应温度下，RTLAMP反应分别在约42、34、29 和27 min 时扩增曲线开始上升。反应结束后，肉眼观察到各温度处理反应液均呈绿色，而空白对照呈橙色（图2）。根据现场检测时间尽可能短的要求，确定65℃为最佳反应温度。
2.2灵敏度检测结果
将感染PeVYV的辣椒病叶片组织总RNA进行10倍系列稀释作为模板，分别进行RTLAMP反应和RTPCR反应。应用RTLAMP方法，在模板稀释倍数为10-4时，反应液呈明显绿色（阳性反应），电泳时扩增的目的条带清晰；当模板稀释倍数为10-5时，反应液也呈现绿色，电泳时仍可见扩增的条带；但模板稀释倍数为10-6时，反应液呈现橙色，电泳无目的条带（阴性反应）（图3～4）。应用RTPCR方法，在模板稀释倍数为10-4时，电泳时扩增的目的条带已经非常弱；当模板稀释倍数为10-5时，RTPCR已不能扩增出目的条带（图5）。因此，检测PeVYV，RTLAMP方法比RTPCR方法灵敏度高10倍。
2.3疑似病样的RTLAMP检测结果
对来自广东省不同辣椒产区的6份疑似感染PeVYV病样，采用RTLAMP方法进行检测，结果显示（图6），疑似病样1号、2号、3号、5号为阳性，4号和6号为阴性。进一步应用RTPCR加以验证，其检测结果（图7）与RTLAMP结果一致，两者的符合率为100%。这表明所建立的PeVYV RTLAMP 检测方法能够实现田间病样的快速、准确检测与诊断。
3讨论
本研究建立的PeVYV RTLAMP 检测方法快速、简便、灵敏和特异。应用该方法可在70 min内完成对PeVYV的检测，而常规的RTPCR检测则需要6 h左右，大幅度缩短了检测时间。整个扩增过程可在恒温水浴锅或烘箱中进行，反应结果可以通过肉眼直接观察扩增反应产物的颜色变化进行判定，检测方法简便，克服了RTPCR检测方法在实际应用中的局限与不足。在灵敏度方面，RTLAMP的检测灵敏度比RTPCR高10倍。另外，由于RTLAMP所利用的引物需要识别靶序列上6个特异性区域，而常规的RTPCR方法引物只识别靶序列上2个特异性区域，因此RTLAMP具有更高的特异性。 由于RTLAMP技术灵敏度高、产物扩增量大，微量的污染（如空气中的阳性气溶胶微粒）都有可能导致假阳性，因此操作过程中一定要保证试验环境、器具以及试剂等免受RNA或扩增产物的污染，检测的各个环节要严格分区进行；同时操作过程尽量减少开盖操作次数等。本研究所建立的PeVYV RTLAMP 检测方法将所有的反应成分及荧光目视检测试剂一次性加入到反应管中进行反应，中间不再开盖，待反应结束后直接观察反应液的颜色来判断结果，大幅度降低了假阳性产生的可能性。
PeVYV是辣椒上重要病毒之一。自1995年Yonaha等在日本首次报道发现PeVYV以来[1]，近几年，亚洲、非洲、欧洲、美洲的多个国家陆续报道发生该病毒。2013年我国台湾首次报道发现该病毒[5]，随后在山东和湖南等省份也检测到该病毒[89]。本团队对广东省辣椒病毒病发生情况进行了调查，发现疑似辣椒黄脉病毒病，应用小RNA测序技术及RTLAMP方法对其病毒种类进行鉴定与检测，发现PeVYV在广东省主要辣椒产区均有分布，疑似病样的检测阳性率为38.3%，且常与甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus，PVMV）、辣椒叶脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）等病毒复合侵染或混合发生，说明PeVYV是引起广东辣椒病毒病的主要病原病毒之一。需要进一步弄清其分布、发生规律及辣椒品种的抗性水平，为预防与控制该病毒病的发生提供科学依据。
参考文献
[1]Yonaha T， Toyosato T， Kawano S， et al. Pepper vein yellows virus， a novel luteovirus from bell pepper plants in Japan [J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1995， 61（3）： 178184.
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[23]Lee M S， Yang M J， Hseu Y C， et al. Onestep reverse transcription loopmediated isothermal amplification assay for rapid detection of Cymbidium mosaic virus [J]. Journal of Virological Methods， 2011， 173（1）： 4348.
（责任编辑：杨明丽）
辣椒黄脉病毒（Pepper vein yellows virus，PeVYV）是影响世界辣椒生产的重要病毒，也是广东省辣椒上主要病原病毒之一。本研究根据PeVYV基因组P3蛋白基因序列设计了2对引物，建立了该病毒的反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RTLAMP）检测方法。该方法70 min便可完成对PeVYV的检测，无需特殊的设备，灵敏度比普通RTPCR高10倍，对田间疑似病样的检出结果与RTPCR的结果一致。本研究建立的PeVYV RTLAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点，适合于对PeVYV病样快速、准确检测与鉴定。
关键词
辣椒黄脉病毒；RTLAMP；快速检测
中图分类号：
S 436.418
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.06.017
Abstract
Pepper vein yellows virus （PeVYV） is an important virus of pepper worldwide. It is also one of the main pathogenic viruses infecting pepper in Guangdong Province. By using primer explorer software， two pairs of primers were designed according to the P3 gene sequence of PeVYV.The reverse transcription loopmediated isothermal amplification （RTLAMP） detection method of PeVYV was developed. The PeVYV detection could be finished within 70 min by using this method and needs no special equipment. Its sensitivity was 10 times higher than that of ordinary RTPCR.The detection result of suspected samples collected from fields by the method was consistent with that by RTPCR.The advantages of RTLAMP detection method for PeVYV were rapid， sensitive and simple. Hence，the method is suitable for rapid and accurate detection and identification of PeVYV.
Key words
Pepper vein yellows virus；RTLAMP；rapid detection
辣椒黄脉病毒（Pepper vein yellows virus，PeVYV）属黄症病毒科（Luteoviridae）马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）成员，由蚜虫以持久方式传播，也可以嫁接传播[1]。该病毒在日本[12]、西班牙[3]、突尼斯、土耳其[4]、印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国[5]、苏丹[6]和美国[7]等国家均有分布。我国的台湾[5]、湖南[8]和山东[9]等省也先后报道了该病毒。辣椒感染黄脉病毒后主要表现为叶脉黄化、叶片卷曲、节间缩短等，其产量和品质受到严重影响。
建立快速、灵敏和特异的检测鉴定方法是植物病毒病诊断、防治和预测预报的前提与基础。目前，PeVYV的检测主要采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）[6，9]。相对于血清学检测方法，该方法较快速（6 h左右）、灵敏和特异，但需要高精度的PCR仪及较复杂的方法来检测扩增产物，使其在日常诊断中受到限制。日本学者Notomi等开发了一种新型的核酸扩增方法——环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技术[10]。该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区域，利用DNA 链置换聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件下对靶基因扩增。RTLAMP 方法是在LAMP 方法的基础上添加了反转录酶（AMV），使反转录和扩增在同一温度下进行。相对RTPCR来说，该技术更加简便、快速（70 min左右）、特异。该技术已被应用于番茄[1112]、柑橘[1314]、香蕉[15]、水稻[1617]、小麦[18]、马铃薯[1921]、草莓[22]、兰花[23]等多种作物的病毒病检测。本文以PeVYV的P3蛋白基因序列为靶标基因，设计了4 条特异性引物，建立了该病毒的RTLAMP快速检测方法。
1材料与方法
1.1材料
感染PeVYV的辣椒病样：采自广东茂名市辣椒产区，经RTPCR检测验证，置于-80℃保存；健康辣椒材料：本实验室在防虫温室中培育的健康辣椒叶片；待检材料：采自广东省各辣椒产区疑似辣椒病叶。
Loopamp RNA 扩增反应试剂盒、Loopamp FD 荧光检测试剂购自日本Eiken Chemical 公司；RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；一步法RTPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；LA320C 实时浊度仪由日本Eiken Chemical 公司提供。 1.2方法
1.2.1引物设计
依据GenBank中已登录的PeVYV基因组（GenBank序列登录号：AB594828.1、KP326573.1）的P3蛋白基因序列，应用LAMP 引物设计软件Primer Explorer V4 （http：∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计外侧引物对F3和B3以及内侧引物对FIP和BIP，将引物在NCBI数据库中PrimerBLAST模块下进行比对验证，最终选出用于RTLAMP的引物组合（表1）。应用PCR引物设计网站（http：∥primer3.ut.ee/），设计目的片段为562 bp的特异引物对PF/PR（表1）用于PeVYV的RTPCR检测。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.2总RNA的提取
取辣椒病叶100 mg，应用RNA提取试剂盒抽提其总 RNA，根据试剂盒说明书的步骤进行操作，最终RNA沉淀溶解于40 μL DEPC处理的ddH2O中。
1.2.3RTLAMP反应体系及最佳反应温度
按照Loopamp RNA 扩增试剂盒的说明配制RTLAMP反应体系，即：2×反应缓冲液12.5 μL，酶溶液1.0 μL，40 pmol/μL引物FIP 1.0 μL，40 pmol/μL引物BIP 1.0 μL，10 pmol/μL引物F3 0.5 μL，10 pmol/μL引物B3 0.5 μL，荧光目视检测试剂1.0 μL，RNA模板10 μL，去离子水6.5 μL，反应总体系为25 μL。反应温度分别设为59℃、61℃、63℃ 和65℃，反应时间为60 min，之后加热至80℃ 5 min使酶失活。扩增反应在实时浊度仪上进行，根据60 min 内出现扩增曲线的最短时间确定最佳反应温度。反应结束后，根据反应液颜色进行判断，若显绿色，则为阳性反应；若显橙色，则判断为阴性反应。进一步通过电泳加以验证，取2 μL扩增产物，在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上100～125 V恒压电泳30 min，然后在紫外检测仪下观察。
1.2.4RTPCR
RTPCR反应参照一步法RTPCR试剂盒说明操作，即：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）25.0 μL，10 μmol/L 引物PF 2.0 μL，10 μmol/L 引物PR 2.0 μL，RNA模板1.0 μL，去离子水18 μL，总体系为50 μL。反应条件为：50℃反转录30 min；94℃预变性4 min，94℃变性30 min、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，35个循环，72℃最终延伸10 min，取 8 μL扩增产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上100～125 V恒压电泳30 min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
1.2.5灵敏度试验
将所提取的辣椒病叶片组织的总RNA按10-1～10-8进行浓度梯度稀释，以不同浓度的RNA作模板，分别进行RTLAMP和普通RTPCR检测，比较两者的检测灵敏度。
1.2.6PeVYV田间疑似病样RTLAMP检测
从广东省各辣椒产区采集疑似感染PeVYV的辣椒病样6份，提取总RNA，分别用1.2.3的RTLAMP方法检测，并用RTPCR 方法加以验证。
2结果与分析
2.1RTLAMP最佳反应温度
以感染PeVYV辣椒病叶组织的总RNA为模板，进行RTLAMP反应，实时浊度仪输出的扩增时间曲线（图1）表明：在59、61、63 和65℃的反应温度下，RTLAMP反应分别在约42、34、29 和27 min 时扩增曲线开始上升。反应结束后，肉眼观察到各温度处理反应液均呈绿色，而空白对照呈橙色（图2）。根据现场检测时间尽可能短的要求，确定65℃为最佳反应温度。
2.2灵敏度检测结果
将感染PeVYV的辣椒病叶片组织总RNA进行10倍系列稀释作为模板，分别进行RTLAMP反应和RTPCR反应。应用RTLAMP方法，在模板稀释倍数为10-4时，反应液呈明显绿色（阳性反应），电泳时扩增的目的条带清晰；当模板稀释倍数为10-5时，反应液也呈现绿色，电泳时仍可见扩增的条带；但模板稀释倍数为10-6时，反应液呈现橙色，电泳无目的条带（阴性反应）（图3～4）。应用RTPCR方法，在模板稀释倍数为10-4时，电泳时扩增的目的条带已经非常弱；当模板稀释倍数为10-5时，RTPCR已不能扩增出目的条带（图5）。因此，检测PeVYV，RTLAMP方法比RTPCR方法灵敏度高10倍。
2.3疑似病样的RTLAMP检测结果
对来自广东省不同辣椒产区的6份疑似感染PeVYV病样，采用RTLAMP方法进行检测，结果显示（图6），疑似病样1号、2号、3号、5号为阳性，4号和6号为阴性。进一步应用RTPCR加以验证，其检测结果（图7）与RTLAMP结果一致，两者的符合率为100%。这表明所建立的PeVYV RTLAMP 检测方法能够实现田间病样的快速、准确检测与诊断。
3讨论
本研究建立的PeVYV RTLAMP 检测方法快速、简便、灵敏和特异。应用该方法可在70 min内完成对PeVYV的检测，而常规的RTPCR检测则需要6 h左右，大幅度缩短了检测时间。整个扩增过程可在恒温水浴锅或烘箱中进行，反应结果可以通过肉眼直接观察扩增反应产物的颜色变化进行判定，检测方法简便，克服了RTPCR检测方法在实际应用中的局限与不足。在灵敏度方面，RTLAMP的检测灵敏度比RTPCR高10倍。另外，由于RTLAMP所利用的引物需要识别靶序列上6个特异性区域，而常规的RTPCR方法引物只识别靶序列上2个特异性区域，因此RTLAMP具有更高的特异性。 由于RTLAMP技术灵敏度高、产物扩增量大，微量的污染（如空气中的阳性气溶胶微粒）都有可能导致假阳性，因此操作过程中一定要保证试验环境、器具以及试剂等免受RNA或扩增产物的污染，检测的各个环节要严格分区进行；同时操作过程尽量减少开盖操作次数等。本研究所建立的PeVYV RTLAMP 检测方法将所有的反应成分及荧光目视检测试剂一次性加入到反应管中进行反应，中间不再开盖，待反应结束后直接观察反应液的颜色来判断结果，大幅度降低了假阳性产生的可能性。
PeVYV是辣椒上重要病毒之一。自1995年Yonaha等在日本首次报道发现PeVYV以来[1]，近几年，亚洲、非洲、欧洲、美洲的多个国家陆续报道发生该病毒。2013年我国台湾首次报道发现该病毒[5]，随后在山东和湖南等省份也检测到该病毒[89]。本团队对广东省辣椒病毒病发生情况进行了调查，发现疑似辣椒黄脉病毒病，应用小RNA测序技术及RTLAMP方法对其病毒种类进行鉴定与检测，发现PeVYV在广东省主要辣椒产区均有分布，疑似病样的检测阳性率为38.3%，且常与甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus，PVMV）、辣椒叶脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）等病毒复合侵染或混合发生，说明PeVYV是引起广东辣椒病毒病的主要病原病毒之一。需要进一步弄清其分布、发生规律及辣椒品种的抗性水平，为预防与控制该病毒病的发生提供科学依据。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）