论文部分内容阅读
目的探讨人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)向血液血管干细胞分化的方法和培养条件。方法人类胚胎干细胞自发分化形成拟胚体(human embyonic bodies,hEBs),与胚胎骨髓基质细胞(human fetal bown marrow stromal cells,hFBMSCs)体外共培养,并添加诱导造血分化的细胞因子如干细胞生长因子(stemcellfactor,SCF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)等因子,诱导分化6d,流式细胞仪进行血液血管干细胞标记KDR+/CD34+的检测,RT-PCR对血液血管干细胞相关基因进行检测,同时对不同浓度的SCF、VEGF、TPO诱导效率进行分析,探讨诱导分化的优化条件,最终形成的条件,再次采用流式细胞学进行验证诱导分化效率的改善。结果hEBs在机制细胞上可以形成血岛样集落,经过消化后,流式检测发现其中KDR+/CD34+细胞比例为4.1%±0.5%,与对照组比较差异有统计学意义。经过RT-PCR检测发现血岛样细胞表达血液血管干细胞相关基因如:人血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain protein receptor,KDR)、干细胞白血病因子(Stem Cell Leucamia,SCL)、B细胞特异性白血病病毒插入位点(B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1,Bmi1)、GATA结合蛋白2(GATA binding protein2,Gata2)、runt相关转录因子1(runt-related transcription factor 1,Runx1)、血小板内皮细胞粘附分子(platelet/endothelial cell adhesion molecule,CD31)、内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体2(endothelium-specific receptor tyrosine kinase2,Tie-2)。在对不同浓度的干细胞因子进行诱导分化,发现在VEGF(10～40ng/ml),SCF(100～300ng/ml)对血液血管干细胞集落的形成有促进作用,在此范围内集落数量和细胞因子成剂量依赖的正相关关系。优化条件后,诱导效率显著提高,KDR+/CD34+细胞为18.8%±2.5%。结论采用基质细胞联合细胞因子共培养的方法可以将人类胚胎干细胞诱导分化为KDR+/CD34+的血液血管干细胞样细胞,300ng/mlSCF、40ng/mlVEGF可以提高诱导分化效率。