论文部分内容阅读
摘 要：为建立一种快速、简便的检测鸽Ⅰ型副粘病毒（PPMV-1）的胶体金免疫层析方法，采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒，胶体金用抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体标记并纯化，包被在玻璃纤维膜上，另外将纯化抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的二抗包被在NC膜上作为检测线和质控线，组装成PPMV-1快速检测条。通过对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等几种样品用试纸条进行灵敏性和特异性检测，结果表明，试剂条只能与新城疫发生交叉反应，而与上述其他样品不发生交叉反应，该试纸条的特异性强，灵敏性高。
关键词：鸽Ⅰ型副粘病毒；胶体金；诊断试纸条；特异性试验
中图分类号：S854.4 3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）06-0090-03
鸽Ⅰ型副粘病毒是一种由禽Ⅰ型副粘病毒引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一。该病于1981年首次在苏丹和埃及的信鸽中发现，随后迅速传播到欧洲、美国和加拿大等地，1985年就已经传到了亚洲。在1986年前后，我国的鸽群中也发现了该病。该病已经给肉鸽养殖业造成了巨大的经济损失[1-8]。因此，对该病的诊断技术和防制措施的研究具有重要意义。现今该病的诊断主要根据临诊症状、病理变化和流行病学进行初步诊断，确诊须经病毒的分离和鉴定。目前常用的诊断方法有ELISA和RT-PCR[9-15]，这些方法往往需要必要的仪器设备和试剂，费时费力，基层兽医部门往往不具备工作条件和技术力量。胶体金快速免疫层析技术是20世纪90年代国外兴起的一种快速诊断技术。国内近年来在医学上研究成功了许多诊断试剂盒或纸条，我们利用单克隆抗体技术和金标免疫层析技术研制快速诊断试剂盒，建立了一种针对鸽Ⅰ型副粘病毒的快速诊断技术。现将该试剂条灵敏性和特异性试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器
干燥箱、电子天平（上海天呈）、生化培养箱、台式冷冻离心机（HEALFORCE）、普通离心机（湖南）、紫外可见分光光度计（上海）、恒温磁力搅拌器（上海）。
1.1.2 主要试剂与材料
氯化金、柠檬酸三钠、碳酸钾、牛血清白蛋白、PEG20000、海藻糖、Tween-20；硝酸纤维素薄膜whatman AE 99和Millipore 135购自上海捷宁生物科技有限公司；玻璃纤维、聚酯膜、PVC板、吸水纸均由上海金标生物科技有限公司提供；羊抗鼠抗体（solabio）、鸽Ⅰ型副粘病毒单克隆抗体，由课题组自制。
1.1.3 病料及毒菌株
鸽Ⅰ型副粘病毒病料（脑、脾、肺）38份，鸡新城疫病料16份、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌样品若干，以上样品由课题组收集保存。
1.2 主要试剂配制
1.2.1 样品垫处理液
含l %（w/v） BSA、l %（w/v）PVP、0.5 % Tween-20和0.02 %（w/v）叠氮钠的 Tris（0.05 M pH 8.5）。
1.2.2 金标复溶液
含20 %（w/v）蔗糖、l %（w/v）BSA、l %（w/v）PVP和0.02 %（w/v）叠氮钠的PBS（0.015 M pH 7.4）。
1.3 方法
1.3.1 胶体金标记物的制备及纯化[16，17]
用柠檬酸还原法制备金溶液，用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金的pH至8.5～9.0。确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：将胶体金溶液调至pH 8.5～9.0后，分装10管，每管1 mL，将抗PPMV-1 F蛋白McAb用适合的稀释液系列稀释成100 μg/mL～ 800 μg/mL，分别取0.1 mL加入1管金溶胶内，对照管加0.1 mL稀释液，混合均匀。放置5 min后，在上述各管内加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察结果（表1）。
确定胶体金标记最适pH：将胶体金用1 mol/L HCl或0.1 mol/L K2CO3调整pH，分别达到6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，各取1 mL，加入最适抗原量，再加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混匀后静置8 h，观察结果（表2）。
在胶体金最低稳定量的基础上再加20 %作为稳定胶体金所需的实际抗体量，调胶体金pH稍高于最适pH，分别取所需量的胶体金和相应量的抗PPMV-1 F蛋白McAb，在搅拌下将金溶胶液和抗体蛋白混合，40 min后再加5 % BSA使其最终浓度为1 %，防止抗体蛋白和胶体金聚合和沉淀。以 3 000 r/min离心20 min，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀。然后4 ℃ 12 000 rpm离心30 min，仔细吸出上清，沉淀物用含1 %BSA的胶体金复溶液溶解，加至原体积的1/10，在4 ℃下保存。
1.3.2 鸽Ⅰ型副粘病毒诊断试剂条制作
（1）样品垫预处理。裁剪玻璃纤维或聚酯膜材质样品垫大小为40 cm×15 mm；将样品垫浸泡于处理液中，使处理液能均匀覆盖全部后取出； 37 ℃干燥后，用装有干燥剂的密封袋室温保存。
（2）金标垫处理。裁剪合适大小的玻璃纤维或聚醋膜作为金标垫，干燥保存备用。将标记上抗PPMV-1 F 蛋白单克隆抗体的胶体金溶液喷于玻璃纤维，37 ℃干燥后，转至装有干燥剂的密封袋，室温保存。
（3）NC膜处理。用 0.01 M pH 7.4 的PBS将抗PPMV-1 F蛋白的单克隆抗体与羊抗鼠二抗分别稀释成不同稀释度。将稀释好的单抗与二抗分别包被于NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线），晾干，然后置于封闭液中，封闭4 h后阴干，装在有干燥剂的密封袋，室温保存。 （4）试纸条组装。将样品垫、胶体金标记抗PPMV-1 F蛋白单抗的玻璃纤维、包被有抗PPMV-1 F蛋白单抗和羊抗鼠抗体的二抗的NC膜，吸水纸，按顺序自上而下粘于双面胶板上，且以相互重叠约l mm左右。组装成后，切割成4 mm宽的纸条，转成胶体金免疫层析试纸条。
1.3.3 鸽Ⅰ型副粘病毒胶体金层析试纸条灵敏性和特异性试验
（1）灵敏性试验。将3份不同血凝价的鸽Ⅰ型副粘病毒尿囊液进行倍比稀释后用试纸条检测，结果见表3。
由表3可以看出，当血凝效价为28样品稀释32倍，血凝效价为27样品稀释16倍后，用所制备的试纸条可以检测为阳性，也就是说所研制的试纸条可以检测血凝效价≥23的病毒液。
（2）特异性试验。将鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等几种样品用试纸条进行检测，只有鸡新城疫与鸽Ⅰ型副粘病毒检测结果一样，都出现两条红色条带，其余样品只有质控线出现红色条带，而检测线没有条带出现。试验结果表明所制备的胶体金检测试纸条可与新城疫发生交叉反应，而与上述其他样品不发生交叉反应，该试纸条的特异性强。
（3）动物试验。在发病后第3天，每天采集棉拭子，并对死亡情况进行记录，及时采集病料，在发病后第5天，对存活的鸡进行捕杀，采集病料，把所采集的病料和棉拭子化开混匀，进行胶体金试纸条的检测（图1），并进行病毒的分离，进行血凝试验和血凝抑制试验，结果见表4。
由表4可知，应用病毒增殖，收集尿囊液进行HA、HI试验，结果与试纸条检测棉拭子的符合率为97.5 %，与试纸条检测病料的符合率为100 %，试纸条检测棉拭子的符合率略低于检测病料的符合率，主要与棉拭子含毒量有关，可能与在棉拭子采集时没有采到有效病料有关。尽管如此，试纸条检测的符合率和病毒分离的符合率也达到97 %以上，说明其特异性是比较强的，可以作为临床检测鸽Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法应用。
2 分析与讨论
本研究建立的鸽Ⅰ型副粘病毒或新城疫病毒的免疫层析快速检测方法灵敏性较强，不与鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等其他样品发生交叉反应，准确性高；通过对临床样品应用试验，结果表明试纸条与HA、HI试验检测方法相比，与检测棉拭子的符合率为97.5 %，与检测病料的符合率为100 %。试纸条检测的符合率和病毒分离的符合率达到97 %以上，说明其灵敏性较高，特异性是比较强的，可以作为临床检测鸽Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法应用。
参考文献：（9篇，略）
关键词：鸽Ⅰ型副粘病毒；胶体金；诊断试纸条；特异性试验
中图分类号：S854.4 3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）06-0090-03
鸽Ⅰ型副粘病毒是一种由禽Ⅰ型副粘病毒引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一。该病于1981年首次在苏丹和埃及的信鸽中发现，随后迅速传播到欧洲、美国和加拿大等地，1985年就已经传到了亚洲。在1986年前后，我国的鸽群中也发现了该病。该病已经给肉鸽养殖业造成了巨大的经济损失[1-8]。因此，对该病的诊断技术和防制措施的研究具有重要意义。现今该病的诊断主要根据临诊症状、病理变化和流行病学进行初步诊断，确诊须经病毒的分离和鉴定。目前常用的诊断方法有ELISA和RT-PCR[9-15]，这些方法往往需要必要的仪器设备和试剂，费时费力，基层兽医部门往往不具备工作条件和技术力量。胶体金快速免疫层析技术是20世纪90年代国外兴起的一种快速诊断技术。国内近年来在医学上研究成功了许多诊断试剂盒或纸条，我们利用单克隆抗体技术和金标免疫层析技术研制快速诊断试剂盒，建立了一种针对鸽Ⅰ型副粘病毒的快速诊断技术。现将该试剂条灵敏性和特异性试验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器
干燥箱、电子天平（上海天呈）、生化培养箱、台式冷冻离心机（HEALFORCE）、普通离心机（湖南）、紫外可见分光光度计（上海）、恒温磁力搅拌器（上海）。
1.1.2 主要试剂与材料
氯化金、柠檬酸三钠、碳酸钾、牛血清白蛋白、PEG20000、海藻糖、Tween-20；硝酸纤维素薄膜whatman AE 99和Millipore 135购自上海捷宁生物科技有限公司；玻璃纤维、聚酯膜、PVC板、吸水纸均由上海金标生物科技有限公司提供；羊抗鼠抗体（solabio）、鸽Ⅰ型副粘病毒单克隆抗体，由课题组自制。
1.1.3 病料及毒菌株
鸽Ⅰ型副粘病毒病料（脑、脾、肺）38份，鸡新城疫病料16份、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌样品若干，以上样品由课题组收集保存。
1.2 主要试剂配制
1.2.1 样品垫处理液
含l %（w/v） BSA、l %（w/v）PVP、0.5 % Tween-20和0.02 %（w/v）叠氮钠的 Tris（0.05 M pH 8.5）。
1.2.2 金标复溶液
含20 %（w/v）蔗糖、l %（w/v）BSA、l %（w/v）PVP和0.02 %（w/v）叠氮钠的PBS（0.015 M pH 7.4）。
1.3 方法
1.3.1 胶体金标记物的制备及纯化[16，17]
用柠檬酸还原法制备金溶液，用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金的pH至8.5～9.0。确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：将胶体金溶液调至pH 8.5～9.0后，分装10管，每管1 mL，将抗PPMV-1 F蛋白McAb用适合的稀释液系列稀释成100 μg/mL～ 800 μg/mL，分别取0.1 mL加入1管金溶胶内，对照管加0.1 mL稀释液，混合均匀。放置5 min后，在上述各管内加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察结果（表1）。
确定胶体金标记最适pH：将胶体金用1 mol/L HCl或0.1 mol/L K2CO3调整pH，分别达到6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，各取1 mL，加入最适抗原量，再加入0.1 mL 10 %NaCl溶液，混匀后静置8 h，观察结果（表2）。
在胶体金最低稳定量的基础上再加20 %作为稳定胶体金所需的实际抗体量，调胶体金pH稍高于最适pH，分别取所需量的胶体金和相应量的抗PPMV-1 F蛋白McAb，在搅拌下将金溶胶液和抗体蛋白混合，40 min后再加5 % BSA使其最终浓度为1 %，防止抗体蛋白和胶体金聚合和沉淀。以 3 000 r/min离心20 min，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀。然后4 ℃ 12 000 rpm离心30 min，仔细吸出上清，沉淀物用含1 %BSA的胶体金复溶液溶解，加至原体积的1/10，在4 ℃下保存。
1.3.2 鸽Ⅰ型副粘病毒诊断试剂条制作
（1）样品垫预处理。裁剪玻璃纤维或聚酯膜材质样品垫大小为40 cm×15 mm；将样品垫浸泡于处理液中，使处理液能均匀覆盖全部后取出； 37 ℃干燥后，用装有干燥剂的密封袋室温保存。
（2）金标垫处理。裁剪合适大小的玻璃纤维或聚醋膜作为金标垫，干燥保存备用。将标记上抗PPMV-1 F 蛋白单克隆抗体的胶体金溶液喷于玻璃纤维，37 ℃干燥后，转至装有干燥剂的密封袋，室温保存。
（3）NC膜处理。用 0.01 M pH 7.4 的PBS将抗PPMV-1 F蛋白的单克隆抗体与羊抗鼠二抗分别稀释成不同稀释度。将稀释好的单抗与二抗分别包被于NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线），晾干，然后置于封闭液中，封闭4 h后阴干，装在有干燥剂的密封袋，室温保存。 （4）试纸条组装。将样品垫、胶体金标记抗PPMV-1 F蛋白单抗的玻璃纤维、包被有抗PPMV-1 F蛋白单抗和羊抗鼠抗体的二抗的NC膜，吸水纸，按顺序自上而下粘于双面胶板上，且以相互重叠约l mm左右。组装成后，切割成4 mm宽的纸条，转成胶体金免疫层析试纸条。
1.3.3 鸽Ⅰ型副粘病毒胶体金层析试纸条灵敏性和特异性试验
（1）灵敏性试验。将3份不同血凝价的鸽Ⅰ型副粘病毒尿囊液进行倍比稀释后用试纸条检测，结果见表3。
由表3可以看出，当血凝效价为28样品稀释32倍，血凝效价为27样品稀释16倍后，用所制备的试纸条可以检测为阳性，也就是说所研制的试纸条可以检测血凝效价≥23的病毒液。
（2）特异性试验。将鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等几种样品用试纸条进行检测，只有鸡新城疫与鸽Ⅰ型副粘病毒检测结果一样，都出现两条红色条带，其余样品只有质控线出现红色条带，而检测线没有条带出现。试验结果表明所制备的胶体金检测试纸条可与新城疫发生交叉反应，而与上述其他样品不发生交叉反应，该试纸条的特异性强。
（3）动物试验。在发病后第3天，每天采集棉拭子，并对死亡情况进行记录，及时采集病料，在发病后第5天，对存活的鸡进行捕杀，采集病料，把所采集的病料和棉拭子化开混匀，进行胶体金试纸条的检测（图1），并进行病毒的分离，进行血凝试验和血凝抑制试验，结果见表4。
由表4可知，应用病毒增殖，收集尿囊液进行HA、HI试验，结果与试纸条检测棉拭子的符合率为97.5 %，与试纸条检测病料的符合率为100 %，试纸条检测棉拭子的符合率略低于检测病料的符合率，主要与棉拭子含毒量有关，可能与在棉拭子采集时没有采到有效病料有关。尽管如此，试纸条检测的符合率和病毒分离的符合率也达到97 %以上，说明其特异性是比较强的，可以作为临床检测鸽Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法应用。
2 分析与讨论
本研究建立的鸽Ⅰ型副粘病毒或新城疫病毒的免疫层析快速检测方法灵敏性较强，不与鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等其他样品发生交叉反应，准确性高；通过对临床样品应用试验，结果表明试纸条与HA、HI试验检测方法相比，与检测棉拭子的符合率为97.5 %，与检测病料的符合率为100 %。试纸条检测的符合率和病毒分离的符合率达到97 %以上，说明其灵敏性较高，特异性是比较强的，可以作为临床检测鸽Ⅰ型副粘病毒和新城疫的方法应用。
参考文献：（9篇，略）